実験室内での多世代進化によるテルペン酵素活性の組織的創出

通过实验室多代进化系统地创造萜烯酶活性

• 批准号: 11J06590
• 负责人: 古林 真衣子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J06590/
• 关键词: テルペノイド; カロテノイド; 代謝工学; 進化工学; 二次代謝; 生合成; 合成生物学

自然界には何万もの生理活性テルペノイドが存在する。これらの生産活性がいかにして生まれたかを知ること, そして多様なテルペン骨格の合成活性を開発することが, 本研究の目的である。テルペン群のすべての分子骨格は, イソプレニル二リン酸の環化によって一段階で形成される。その生合成を行うテルペン環化酵素は, 基質から二リン酸を脱離させ, そこで生じるカルボカチオンに分子内のどの二重結合を求電子攻撃させるかを規定する「反応シャペロン」の役割を担う。この特異な機構から, 少ないアミノ酸変異によっても, 大きくその生産物の構造を変化し得ることが予言されてきた。申請者はこれまで, テルペン酵素の細胞活性を, 共通するイソプレニル二リン酸を基質とするカロテノイド色素経路の生産量低下によって可視化する手法を開発してきた。本研究では, この手法を用いて, ひとつのテルペン酵素から多様なテルペン活性をつくり出すことを目指した。採用期間の初年度では, スクリーニング手法を完成させ, 論文として発表した。その後, 二, 三年次においては本手法を用いて, バジル由来ゲラニオール合成酵素, タバコ由来5-エピアリストロケン合成酵素およびマツ由来ビサボレン合成酵素を対象として, 数世代の進化工学を行った。そこで得られた変異体から, 生産物特異性を変更させるものを単離した。その変異体解析によって, テルペンの反応特異性を改変し得るアミノ酸部位を複数特定することができた。これらの結果は, テルペン合成酵素が数アミノ酸変異による小さな構造変化によって反応特異性が大きく変わり得ることを, そしてその変化が大きな活性低下を伴うことなく起こり得ることを示すものである。

自然界中存在数以万计的具有生物活性的萜类化合物。本研究的目的是了解这些生产活动是如何产生的，并开发各种萜烯骨架的合成活动。萜烯基团的所有分子骨架都是通过二磷酸异戊二烯基环化一步形成的。进行生物合成的萜烯环化酶起着“反应伴侣”的作用，将二磷酸盐从底物上分离出来，并确定分子中的哪个双键受到所产生的碳阳离子的亲电攻击。从这种独特的机制，可以预测即使是很小的氨基酸突变也可以显着改变产品的结构。迄今为止，申请人已经开发了一种通过使用常见的异戊二烯基二磷酸作为底物减少类胡萝卜素色素的产生来可视化萜烯酶的细胞活性的方法。在这项研究中，我们的目的是使用这种方法从单一萜烯酶中产生多种萜烯活性。招募期的第一年，筛选方法就完成了，并发表在论文中。随后，在第二年和第三年，我们利用该方法对来自罗勒的香叶醇合酶、来自烟草的5-epialistrochene合酶和来自松树的红没药烯合酶进行了几代进化工程。从获得的突变体中，我们分离出那些改变产物特异性的突变体。通过突变体分析，我们能够识别出多个可以改变萜烯反应特异性的氨基酸位点。这些结果表明，萜烯合酶的反应特异性可以通过由少数氨基酸突变引起的小的结构变化而显着改变，并且这种变化可以在活性不显着降低的情况下发生。

项目成果

Evolutionary engineering of biosynthetic pathways for non-natural C50 carotenoids.

非天然 C50 类胡萝卜素生物合成途径的进化工程。

• 发表时间: 2012
• 作者: Furubayashi M;Ling L;Takaichi S;Saito K & Umeno D
• 通讯作者: Saito K & Umeno D

人工代謝経路を用いたC50-β-Caroteneの全合成

利用人工代谢途径全合成C50-β-胡萝卜素

• 发表时间: 2011
• 作者: 古林真衣子;生悦住茉友;高市真一;斎藤恭一;梅野太輔
• 通讯作者: 梅野太輔

非天然カロテノイド経路における不飽和化酵素の進化分子工学

非天然类胡萝卜素途径去饱和酶的进化分子工程

• 发表时间: 2012
• 作者: 古林真衣子;李伶;高市真一;斎藤恭一;梅野太輔
• 通讯作者: 梅野太輔

基質消費スクリーニングを用いたゲラニオール合成酵素の細胞活性進化

使用底物消耗筛选研究香叶醇合酶细胞活性的演变

• 发表时间: 2011
• 作者: 梶原順;生悦住茉友;岩崎美希;古林真衣子;斎藤恭一;梅野太輔
• 通讯作者: 梅野太輔

人工代謝経路による非天然C_<50>-β-caroteneの生合成

人工代谢途径生物合成非天然C_<50>-β-胡萝卜素

• 发表时间: 2011
• 作者: 古林真衣子;生悦住茉友;高市真一;斎藤恭一;梅野太輔
• 通讯作者: 梅野太輔