蛍光分子センサーを用いたDNA修復の解析

使用荧光分子传感器分析 DNA 修复

• 批准号: 11J03948
• 负责人: 栂 達也
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J03948/
• 关键词: ヌクレオチド除去修復; 色素性乾皮症; 紫外線DNA損傷

本研究はヒトのヌクレオチド除去修復機構(NER)を、蛍光を利用し検出する分子センサーの創製を目的としている。NERは紫外線により生じる「紫外線DNA損傷」などの比較的構造変化の大きいDNA損傷を修復する役割を担っている。このNERが欠損した遺伝性疾患として色素性乾皮症(XP)が知られており、日光を浴びると高頻度に皮膚がんを発症するといった病態を呈する。従ってXP患者を早期に発見し、紫外線への曝露を防ぐことは大変重要である。本分子センサーは、XP診断への応用が可能であると考えられるため、XP患者早期発見への貢献が期待される。センサーは紫外線損傷を含む2本鎖DNAに蛍光分子と消光分子を取り付けたもので、NERが起こると蛍光分子を含む鎖が解離して蛍光が発せられる。前年度まで試作していたものは直鎖2本鎖DNAを基本骨格としており、これがNERの基質となることが示された。しかしシグナルノイズ比が悪く、さまざまな改善を試みたが実用には至らなかった。この型に対し、本年度には新たに環状型センサーを試作した。直鎖型に対する利点として、その安定性とNER効率の向上を狙ったものである。この環状型センサーの調製に成功し、HeLa細胞抽出液を用いてこれがNERの基質となることを示した。そしてHeLa細胞への導入を行ったところ、センサー中の損傷の存在に依存した蛍光が検出された。またXP-A患者細胞ならびにこの細胞にXPAを相補した細胞に対し同様にセンサーの導入を行ったところ、細胞のNER活性が正常な場合にのみ蛍光が検出された。つまりこれらの実験から、センサーが損傷依存的かつNER依存的に蛍光を発する機能があることが示された。意図した機能を有するセンサーを得ることが出来たため、当初の目的通り、今後はXP患者の診断への実用に向け、必要に応じて分子構造の調製を行っていく必要がある。

这项研究旨在创建一种分子传感器，利用荧光来检测人类核苷酸切除修复机制（NER）。 NER起到修复引起比较大的结构变化的DNA损伤的作用，例如紫外线引起的“紫外线DNA损伤”。着色性干皮病 (XP) 被认为是一种由这种 NER 缺陷引起的遗传性疾病，并且表现出一种病理状况，其中暴露在阳光下时经常会发生皮肤癌。因此，及早发现 XP 患者并防止暴露于紫外线非常重要。由于这种分子传感器被认为适用于 XP 诊断，因此有望有助于 XP 患者的早期发现。该传感器是通过将荧光分子和猝灭剂分子附着在含有紫外线损伤的双链DNA上而制成的，当NER发生时，含有荧光分子的链会解离并发出荧光。去年之前生产的原型具有线性双链 DNA 的基本骨架，它被证明是 NER 的底物。然而，信噪比很差，尽管尝试了各种改进，但都没有投入实际使用。与这种类型相反，今年推出了一种新的环形传感器原型。其目的是提高稳定性和 NER 效率，作为相对于线性类型的优势。我们成功制备了这种环形传感器，并证明它可以作为使用 HeLa 细胞提取物进行 NER 的底物。当引入 HeLa 细胞时，根据传感器是否存在损坏来检测荧光。当将传感器类似地引入 XP-A 患者细胞和补充有 XPA 的细胞时，仅当细胞具有正常 NER 活性时才检测到荧光。换句话说，这些实验表明该传感器具有以损伤依赖性和NER依赖性方式发射荧光的能力。由于我们能够获得具有预期功能的传感器，因此有必要按照最初的预期准备实际用于诊断 XP 患者所需的分子结构。

项目成果

A transfection reporter for the prevention of false-negative results in molecular beacon experiments.

用于防止分子信标实验中出现假阴性结果的转染报告基因。

• DOI: 10.1016/j.ab.2013.04.027
• 发表时间: 2013
• 期刊: Analytical Biochemistry
• 影响因子: 2.9
• 作者: Tatsuya Toga;Isao Kuraoka;Akira Yasui;Shigenori Iwai
• 通讯作者: Shigenori Iwai

Fluorescent probes for the detection of base excision repair in cells

用于检测细胞中碱基切除修复的荧光探针

• 发表时间: 2011
• 作者: Tomohiro;T.;栂達也
• 通讯作者: 栂達也