発生工学プロテオミクスを用いた胸腺特異的ユビキチンリガーゼの機能解析

使用发育蛋白质组学对胸腺特异性泛素连接酶进行功能分析

基本信息

批准号：
11J03061
负责人：
山内隆好
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J03061/
关键词：
ユビキチン F-boxタンパク質プロテオミクスユビキチン化酵素

项目摘要

前年度までに、「インタラクション・プロテオミクス法」の改良(用いる細胞株の変更や遺伝子導入法の検討)を行うことで、新たなFbxl12の基質候補を同定した。これを受け、まず培養細胞レベルでのこの基質候補に対する同様の評価実験をHEK293T細胞から急性リンパ性白血病由来のJurkat細胞へと系を移して行った。しかしながら、Fbxl12ノックダウン条件において、この基質候補の有意な蓄積が認められず、タンパク半減期の遅延も認められないことが明らかとなった。更に、発現量に関する解析の結果、この新規基質候補の発現が造血幹細胞からリンパ球系細胞への分化にかけて非常に低いということが明らかとなった。この結果を受け、「インタラクション・プロテオミクス法」の改良に加えて、Fbxl12KOマウスとiTRAQ法を用いた、「リバース・プロテオミクス法」による新規基質の探索を現在試みている段階である。前段階の実験結果として、幾つかの可能性のある因子を同定することに成功しており、「リバース・プロテオミクス法」の結果の再現性を得る実験と同時に並行して基質候補として同定されたものについて、WTとFbxl12KOマウスの胸腺組織を用いた解析を行っている。具体的には、基質遺候補伝子の定現量や発現部位の変化を解析すること、Fbxl12KOマウスの胸腺組織細胞でのRNAiによる下流遺伝子の安定性に対する表現型改善の有無やFACSによるT細胞の系譜の変化等を解析すること等を試みている。

到前一年，我们通过改进“相互作用蛋白质组学方法”（改变所使用的细胞系并检查基因导入方法），确定了Fbxl12的新底物候选物。针对这一点，我们首先通过将系统从 HEK293T 细胞转移到源自急性淋巴细胞白血病的 Jurkat 细胞，在培养细胞水平上对该候选底物进行了类似的评估实验。然而，研究表明，在 Fbxl12 敲低条件下，没有观察到该候选底物的显着积累，并且没有观察到蛋白质半衰期的延迟。此外，表达水平分析表明，在造血干细胞向淋巴细胞分化过程中，这种新型底物候选物的表达极低。基于这些结果，除了改进“相互作用蛋白质组学方法”之外，我们目前正在尝试使用使用Fbxl12KO小鼠的“反向蛋白质组学方法”和iTRAQ方法来寻找新的底物。通过前期实验，我们成功地确定了几个可能的因素，并与实验并行地确定了这些候选底物，以获得“反向蛋白质组学方法”结果的再现性，我们正在使用胸腺进行分析。来自 WT 和 Fbxl12KO 小鼠的组织。具体而言，我们将通过FACS分析Fbxl12KO小鼠胸腺组织细胞和T细胞中底物基因候选基因的表达水平和表达位点的变化，以及RNAi是否对下游基因的稳定性有表型改善。正在分析家谱的变化