細菌α-ケト酸還元酵素の構造機能相関解析による補酵素要求性の変換とその応用

细菌α-酮酸还原酶构效关系分析换算辅酶需要量及其应用

基本信息

批准号：
11J00050
负责人：
高瀬隆一
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

<背景と目的>本研究では、アルギン酸などの酸性多糖から生じる不飽和ウロン酸(α-ケト酸)を基質として、異なる補酵素特異性を示す細菌由来α-ケト酸還元酵素(A1-RやKduDなど)の構造機能相関を解析することにより、補酵素要求性を決定する構造要因の解明を目的とする。また、還元酵素における補酵素要求性の相違が、細菌における酸性多糖の代謝に及ぼす生理的意義について理解を深める。<結果と考察>Spinhgemonas, 属細菌A1株において、NADPH要求性A1-Rの機能を低下させた変異株を作製した。本変異株の性状解析より、A1-Rとは異なる新規なα-ケト酸還元酵素(Al-R')の存在が示唆された。そこでA1株細胞抽出液より7種類のカラムクロマトグラフィーを用いてA1-R'を精製した。N末端シーケンスとA1株ゲノムデータベースより、本酵素の遺伝子(ID ; sph1210)を同定した。Al-RとA1-R'は一次構造上高い相同性(64%)を示し、それらの酵素学的特性は補酵素要求性を除いて類似していた。A1-R'はA1-Rと異なり、NADH要求性を示した。A1-R'の発現・精製系を確立し、X線結晶構造解析を行い、補酵素との複合体(A1-R'/NAD^+)の立体構造を明らかにした。A1-RとA1-R'の補酵素結合部位を比較したところ、補酵素のヌクレオシドリボース2'位のリン酸基周辺に相違が認められた。A1-Rと異なり、A1-R'は負電荷を帯び、結合部位の空間が狭くなっていた。これらの相違を生み出す残基は、5残基と7残基からなる二本のループ上に存在していた。この二本のループの役割を明らかにするため、二本のループを交換したA1-R'変異体を作製し、その速度パラメーターを決定した。その結果、得られた変異体は、強い活性を保ったまま補酵素要求性のみが変換されていた(NADH→NADPH)。以上より、α-ケト酸還元酵素において、二本のループの特性が補酵素要求性を決定していることを明らかにした。A1株は補酵素要求性の異なる二種類のα-ケト酸還元酵素を用いることで、補酵素バランスの変動にかかわらず、α-ケト酸を速やかに代謝することができると考えられる。

<背景和目的>本研究旨在通过分析细菌衍生的α-酮酸还原酶（例如A1-R和KDUD）的结构功能相关性来阐明确定辅酶需求的结构因素，从而使用酸（α-酮酸）的酸酸盐酸盐酸盐酸盐酸盐酸盐，从而表现出不同的共酶特异性。我们还将加深对还原酶中辅酶需求差异对细菌酸性多糖代谢的生理意义的理解。 <结果与讨论>在A1属A1属中产生了一种突变菌株，该突变菌株降低了NADPH重新征用A1-R的功能。该突变菌株的表征表明存在与A1-R不同的新型α-酮酸还原酶（AL-R'）的存在。因此，使用七种不同的色谱柱色谱法从A1细胞提取物中纯化A1-R'。从N末端序列和A1基因组数据库中鉴定出该酶的基因（ID； SPH1210）。 AL-R和A1-R'表现出高的原发性同源性（64％），除了辅酶需求外，它们的酶特性相似。与A1-R'不同，A1-R'表现出NADH要求。建立了A1-R'的表达和纯化系统，并进行了X射线晶体结构分析，以阐明与辅酶（A1-R'/NAD^+）的复合物的三维结构。当比较A1-R和A1-R'的辅酶结合位点时，在辅酶的核苷核糖核糖2'位置周围发现了差异。与A1-R不同，A1-R'是负电荷的，并且结合位点空间被缩小。产生这些差异的残基在两个循环中存在，由五个和七个残基组成。为了阐明这两个循环的作用，生成了A1-R'突变体，以交换两个循环，并确定其速率参数。结果，所产生的突变体仅转换为辅酶需求，同时保持强大的活性（NADH→NADPH）。从上面可以揭示出两个环的性质确定α-酮酸还原酶中的辅酶需求。通过使用具有不同辅酶需求的两种类型的α-酮酸还原酶，无论辅酶平衡的变化如何，A1菌株都可以快速代谢α-酮酸。