細菌α-ケト酸還元酵素の構造機能相関解析による補酵素要求性の変換とその応用

细菌α-酮酸还原酶构效关系分析换算辅酶需要量及其应用

基本信息

批准号：
11J00050
负责人：
高瀬隆一
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

<背景と目的>本研究では、アルギン酸などの酸性多糖から生じる不飽和ウロン酸(α-ケト酸)を基質として、異なる補酵素特異性を示す細菌由来α-ケト酸還元酵素(A1-RやKduDなど)の構造機能相関を解析することにより、補酵素要求性を決定する構造要因の解明を目的とする。また、還元酵素における補酵素要求性の相違が、細菌における酸性多糖の代謝に及ぼす生理的意義について理解を深める。<結果と考察>Spinhgemonas, 属細菌A1株において、NADPH要求性A1-Rの機能を低下させた変異株を作製した。本変異株の性状解析より、A1-Rとは異なる新規なα-ケト酸還元酵素(Al-R')の存在が示唆された。そこでA1株細胞抽出液より7種類のカラムクロマトグラフィーを用いてA1-R'を精製した。N末端シーケンスとA1株ゲノムデータベースより、本酵素の遺伝子(ID ; sph1210)を同定した。Al-RとA1-R'は一次構造上高い相同性(64%)を示し、それらの酵素学的特性は補酵素要求性を除いて類似していた。A1-R'はA1-Rと異なり、NADH要求性を示した。A1-R'の発現・精製系を確立し、X線結晶構造解析を行い、補酵素との複合体(A1-R'/NAD^+)の立体構造を明らかにした。A1-RとA1-R'の補酵素結合部位を比較したところ、補酵素のヌクレオシドリボース2'位のリン酸基周辺に相違が認められた。A1-Rと異なり、A1-R'は負電荷を帯び、結合部位の空間が狭くなっていた。これらの相違を生み出す残基は、5残基と7残基からなる二本のループ上に存在していた。この二本のループの役割を明らかにするため、二本のループを交換したA1-R'変異体を作製し、その速度パラメーターを決定した。その結果、得られた変異体は、強い活性を保ったまま補酵素要求性のみが変換されていた(NADH→NADPH)。以上より、α-ケト酸還元酵素において、二本のループの特性が補酵素要求性を決定していることを明らかにした。A1株は補酵素要求性の異なる二種類のα-ケト酸還元酵素を用いることで、補酵素バランスの変動にかかわらず、α-ケト酸を速やかに代謝することができると考えられる。

<背景和目的> 在本研究中，我们研究了细菌α-酮酸还原酶（A1-R和KduD等的结构与功能关系，旨在阐明决定辅酶需求的结构因素）。我们还将加深对还原酶辅酶需求差异对细菌酸性多糖代谢的生理意义的理解。 <结果与讨论> 我们创建了A1属Spinhgemonas突变株，其中需要NADPH的A1-R的功能被降低。该突变株的特征分析表明存在一种不同于A1-R的新型α-酮酸还原酶(Al-R')。因此，使用七种柱色谱法从A1细胞提取物中纯化A1-R'。该酶的基因（ID；sph1210）是从 N 端序列和 A1 菌株基因组数据库中鉴定出来的。 Al-R和A1-R'在一级结构上表现出较高的同源性(64%)，除了辅酶需要量外，它们的酶学性质相似。与 A1-R 不同，A1-R' 显示 NADH 需求。我们建立了A1-R'的表达和纯化系统，进行了X射线晶体结构分析，阐明了与辅酶（A1-R'/NAD^+）复合物的三维结构。当比较A1-R和A1-R'的辅酶结合位点时，在辅酶核苷核糖2'位置的磷酸基团周围观察到差异。与 A1-R 不同，A1-R' 带负电荷并且具有狭窄的结合位点空间。造成这些差异的残基位于 5 个和 7 个残基的两个环上。为了阐明这两个环的作用，我们创建了两个环交换的 A1-R' 突变体，并确定了其动力学参数。结果，获得的突变体仅改变了辅酶需求（NADH→NADPH），同时保持了较强的活性。上述结果表明，α-酮酸还原酶的两个环的特性决定了辅酶的需求量。通过使用两种具有不同辅酶需求的α-酮酸还原酶，A1菌株被认为能够快速代谢α-酮酸，而不管辅酶平衡如何变化。