歯の移動に伴う破骨細胞性骨吸収活性化と痛みの関連性解析

破骨细胞骨吸收激活与牙齿移动疼痛的关系分析

基本信息

批准号：
17791530
负责人：
辻康夫
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791530/
关键词：
破骨細胞 TRPV RT-PCR 免疫染色

项目摘要

歯の移動に伴い、骨吸収機構活性化が惹起され、また不快な痛みが出現する。両者は、ほぼ同時に出現することから何らかの関連があるものと推察される。本研究においては、カルシウム透過性カチオンチャネルであり、機械的刺激、酸、熱により活性化されるTransient potential vanilloid:TRPVsが破骨細胞におけるカルシウムに対するセンサー/レセプターとして発現、機能し、痛みにも関していることを仮説として研究を開始した。(1)破骨細胞におけるTRPV1,2タンパクの発現について:(in vivo)4週齢ddyマウスを灌流固定後、脛骨骨頭を採取、脱灰後、8μm切片を作製し、抗TRPV1,2抗体を用いて、ABC法により検索した。両タンパクとも、破骨細胞のみならず、骨芽細胞、骨髄中の多核(2,3核)細胞にも認められた。破骨細胞における局在は、TRPV1は、細胞質全体的な局在が認められたのに対してTRPV2は、細胞膜に強い発現が認められた。(in vitro)6週齢ddyマウスより骨髄細胞を採取、M-CSF,RANKL刺激のもとで5日間培養し、破骨細胞様細胞を形成。抗TRPV1,2抗体にて免疫蛍光染色ならびにTRAP染色の二重染色を行って居るところである。しかしながら、多核破骨細胞様細胞の形成が思わしくなく、蛍光染色にまでは至っていない。今後、M-CSF,RANKL濃度、培養条件を再検討中である。※また、培養条件改善後に、形成された破骨細胞をプレートより剥離し、total RNAを抽出し、TRPV1,2特異的プライマーを用いてRT-PCRを行い、破骨細胞におけるTRPV1,2 mRNA検索を予定。(2)骨組織におけるTRPV1,2mRNAの発現について:6週齢ddyマウス脛骨よりtotal RNAを抽出しTRPV1,2特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。TRPV1,2mRNAは、骨組織に特異的に認められた。今後は、特異的に認められたバンドについて、定量化を行い、他の破骨細胞特異的マーカー(カテプシンK,TRAPなど)と比較検討する予定である。破骨細胞において、TRPV1,2が認められたことにより熱(炎症)、機械的刺激により本レセプターが活性化、チャネルの開放が生じ、細胞内へカルシウムが流入することにより細胞が活性化するものと考えているが、実験技術等の改善を図り、さらなる論証を獲得すべく研究を遂行するつもりである。

当牙齿移动时，骨吸收机制被激活，并发生令人不快的疼痛。假设两者之间存在某种关系，因为它们几乎同时出现。在这项研究中，我们证明了瞬态电位香草酸（TRPV）是一种由机械刺激、酸和热激活的钙渗透性阳离子通道，在破骨细胞中作为钙传感器/受体表达和发挥作用，并且也与疼痛有关。我们从以下假设开始我们的研究(1)关于破骨细胞中TRPV1,2蛋白的表达：(体内)4周龄DDY小鼠灌注固定后，收获胫骨头，脱钙，制备8μm切片，进行搜索。 ABC法。这两种蛋白质不仅存在于破骨细胞中，而且存在于骨髓中的成骨细胞和多核（双核和三核）细胞中。关于破骨细胞中的定位，发现TRPV1定位于整个细胞质，而TRPV2被发现在细胞膜中强烈表达。 (体外) 采集6周龄ddy小鼠的骨髓细胞，在M-CSF和RANKL刺激下培养5天，形成破骨细胞样细胞。我们目前正在使用抗TRPV1,2抗体进行免疫荧光染色和TRAP染色的双重染色。然而，多核破骨细胞样细胞的形成并不令人满意，并且无法进行荧光染色。我们目前正在重新考虑 M-CSF、RANKL 浓度和培养条件。 *此外，改善培养条件后，将形成的破骨细胞从平板上分离，提取总RNA，并计划使用TRPV1,2特异性引物进行RT-PCR以搜索破骨细胞中的TRPV1,2 mRNA。 (2)关于骨组织中TRPV1,2 mRNA的表达：从6周龄ddy小鼠胫骨中提取总RNA，使用TRPV1,2特异性引物进行RT-PCR。 TRPV1,2 mRNA 在骨组织中被特异性观察到。未来，我们计划对具体观察到的条带进行量化，并将其与其他破骨细胞特异性标记物（组织蛋白酶 K、TRAP 等）进行比较。由于在破骨细胞中观察到TRPV1和2，该受体被热（炎症）和机械刺激激活，发生通道开放，钙流入细胞，从而激活细胞。改进实验技术并获得进一步的证据。