ポストゲノム時代に対応する人工制限酵素の開発

后基因组时代人工限制性内切酶的开发

基本信息

批准号：
16750140
负责人：
須磨岡淳
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度開発した1本鎖DNAを塩基配列特異的に切断する人工酵素が、バイオテクノロジーのツールとして実際に応用が可能であるかについて検討した。今回は、遺伝子組み換えを行うターゲット長鎖DNAとして、GFP遺伝子およびBFP遺伝子を選択した。これは、GFP遺伝子とBFP遺伝子との間で、わずか数アミノ酸が異なるだけであり、さらには同じアミノ酸をコードしているがコドンが異なる部分があるために、目的の組換え操作の実証には最適と判断したからである。まず、人工制限酵素を用いてGFP遺伝子をターゲット部位で切断し、この断片と別途調製したBFP遺伝子の一部とをリガーゼを用いて結合し、組換えDNAを調製した。塩基配列を確認したところ、目的の組換えDNAが調製されていることが確認された。さらに、この組換えDNAを大腸菌に導入し、BFPの発現に関しても確認した。これら結果は、今回開発した人工制限酵素が、遺伝子工学やゲノム機能解析などの次世代ツールとして、有効であることを強く示唆するものである。また、より高活性な人工制限酵素を構築するために、 Ce(IV)によるリン酸ジエステル結合の切断のメカニズムについて検討を行った。Ce(IV)が均一な低いpH条件での動力学的な解析の結果、 Ce(IV)は単独で働くのではなく、複核のクラスターを形成し、これがリン酸ジエステル加水分解に主要な役割を果たしていることが明らかになった。この結果は、生理条件下においても、Ce(IV)がクラスターで作用していることを強く示唆するものである。従って、より高活性な人工制限酵素の開発のためには、Ce(IV)を多核で含むような錯体の構築が必須であることが明らかになった。

我们研究了去年开发的以序列特异性方式切割单链 DNA 的人工酶是否真的可以用作生物技术工具。这次，我们选择了GFP基因和BFP基因作为长链DNA基因改造的靶点。这是因为GFP基因和BFP基因仅在少数氨基酸上存在差异，并且即使它们编码相同的氨基酸，也存在具有不同密码子的部分，因此很难证明所需的重组操作。被判定为最优。首先，使用人工限制酶在靶位点切割GFP基因，并使用连接酶将该片段与单独制备的BFP基因的一部分连接以制备重组DNA。当碱基序列得到确认时，就证实已制备出所需的重组DNA。此外，将该重组DNA导入大肠杆菌中，也确认了BFP的表达。这些结果强烈表明，新开发的人工限制性酶作为基因工程和基因组功能分析的下一代工具是有效的。此外，为了构建更高活性的人工限制性内切酶，我们研究了Ce(IV)裂解磷酸二酯键的机制。在 Ce(IV) 为均质的低 pH 条件下进行的动力学分析表明，Ce(IV) 不会单独起作用，而是形成双核簇，这在磷酸二酯水解中发挥着重要作用。这一结果强烈表明，即使在生理条件下，Ce(IV) 也会以簇的形式发挥作用。因此，很明显，为了开发具有更高活性的人工限制性内切酶，有必要构建含有多核Ce(IV)的复合物。