DNA修複において重要な役割をもつ、ミスマッチ修複系酵素群の構造機能解析

在 DNA 修复中发挥重要作用的错配修复酶的结构和功能分析

基本信息

批准号：
05J09716
负责人：
福井健二
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J09716/
关键词：
DNA組換え DNA修復ヌクレアーゼゲノム安定性ホリデイ構造

项目摘要

DNA修復系酵素MutSファミリーのうち、MutS2に着目し、その分子機能解析をおこなった。高度好熱菌mutS2の遺伝子破壊株を作製し、表現型を野生株と比較したところ、mutS2欠損株では、高い相同組換え効率を示すこと、マイトマイシンCに対する耐性が上昇していることが分かった。また、生化学的な解析から、MutS2は、相同組換えの一般的な中間体であるD-loop構造を認識し、切断する活性を持つ事が示唆された。さらに、D-loop構造を切断するヌクレアーゼ活性がMutS2のC末端に存在するSmrドメインに由来することを部位特異的変異導入法により明らかにした。このドメインはバクテリアからヒトまで高度に保存された機能未知のドメインであったが、本研究により新奇のヌクレアーゼドメインであることが示された。そこで、このドメインのヌクレアーゼ活性を詳細に調べるために、フーリエ変換型質量分析計を用いた解析法を確立した。この解析により、Smrドメインのヌクレアーゼ活性は、配列特異性を持たない事、ホスホジエステル結合をリン酸基の5'側で加水分解する事などが分かった。これは、フーリエ変換型質量分析計によりヌクレアーゼ活性を解析した初めての例である。以上の結果から、MutS2は相同組換え申間体を認識し、解離させることにより相同組換えを抑制すると考えられる。相同組換えは、外来DNAの取り込みなどを伸介する反応であり、これを制御することによりゲノムの安定性の維持に関与しているといえる。

在 DNA 修复酶 MutS 家族中，我们重点关注 MutS2 并分析了其分子功能。当我们创建了一个基因破坏的超嗜热菌株 mutS2 并将其表型与野生菌株进行比较时，我们发现 mutS2 缺陷菌株表现出较高的同源重组效率和对丝裂霉素 C 的抗性增加。此外，生化分析表明MutS2具有识别和切割D环结构的能力，D环结构是同源重组中常见的中间体。此外，我们通过定点诱变揭示了切割 D 环结构的核酸酶活性源自位于 MutS2 C 末端的 Smr 结构域。这个结构域从细菌到人类都是高度保守的，其功能尚不清楚，但这项研究表明它是一个新的核酸酶结构域。因此，为了详细研究该结构域的核酸酶活性，我们建立了使用傅里叶变换质谱仪的分析方法。该分析表明，Smr 结构域的核酸酶活性没有序列特异性，并且水解磷酸基团 5' 侧的磷酸二酯键。这是首次使用傅里叶变换质谱仪分析核酸酶活性。根据以上结果，认为MutS2通过识别并解离同源重组间质体来抑制同源重组。同源重组是介导外源DNA掺入的反应，对其进行控制可以说与维持基因组稳定性有关。