コンドロイチン/デルマタン硫酸の硫酸化を担う硫酸基転移酵素群の生物学的意義の解明

阐明负责软骨素/硫酸皮肤素硫酸化的磺基转移酶的生物学意义

基本信息

批准号：
16790068
负责人：
三上雅久
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kobe Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖の一群に分類されるコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸(CS/DS)は形態形成や細胞間相互作用など生命活動に必須な役割を果している。最近のin vitroでの研究から、CS/DSの特定の硫酸化構造がその生物機能発現に重要であることがわかってきた。本研究では、CS/DSの特異的硫酸化構造と生物機能との相関をin vivoで明らかにするため、CS/DSの硫酸化を触媒する硫酸基転移酵素に焦点を当て、分子生物学的解析を行なった。(1)脊椎動物のCS/DSにおいて、主要な硫酸化修飾構造であるGalNAcの4位の硫酸化を担う硫酸基転移酵素の一つであるC4ST-1の機能をアンチセンス法によりゼブラフィッシュ胚でノックダクンし、その表現型を解析した。C4ST-1に特異的なアンチセンスモルフォリノオリゴをゼブラフィッシュに導入した胚(C4ST-1モルファント)は、体軸や尾部が曲がったり、ねじれたりする形態異常を示した。受精後48時間目のC4ST-1モルファントよりグリコサミノグリカン糖鎖画分を調製し、CS/DSの二糖組成分析を行った結果、野生型胚由来のCS/DSと比較して、GalNAcの4位が硫酸化された二糖の割合は顕著に減少していた。従って、C4ST-1モルファントで観察された形態異常は、CS/DS鎖中のGalNAcの4位の硫酸化の低下、もしくはCS/DSの構造変化により引き起こされた可能性が強く示唆された。(2)これまでの研究から、CS/DSハイブリッド糖鎖には、神経突起伸長促進作用や種々の増殖因子と強い結合親和性を持つことが明らかにされている。しかし、そのように機能的なDS構造をもつ糖鎖が、哺乳類の脳のどの領域に発現しているかは不明である。そこで、マウスの生後発達段階における硫酸基転移酵素群の発現をin situ hybridizationにより調べると共に、脳切片を用いたCS/DSの二糖組成分析を行なった。その結果、種々の硫酸基転移酵素のうち、DS鎖の生合成に関わる2種類の硫酸基転移酵素(D4ST-1とUST)が小脳に強く発現していることを見出した。二糖組成解析からも、小脳には他の領域に比べ、DSに特徴的な二糖単位が多く含まれていることがわかった。従って、DS鎖が小脳の神経回路網の形成に深く関与していることが示唆された。

硫酸软骨素/硫酸皮肤素（CS/DS）属于一组硫酸化糖胺聚糖糖链，在形态发生和细胞间相互作用等生命活动中发挥着重要作用。最近的体外研究表明，CS/DS的特定硫酸化结构对其生物学功能的表达非常重要。本研究为了阐明CS/DS的特定硫酸化结构与体内生物学功能的相关性，我们重点对催化CS/DS硫酸化的磺基转移酶进行了分析。 (1) 使用反义方法在斑马鱼胚胎中研究了 C4ST-1 的功能，C4ST-1 是一种负责 GalNAc 4 位硫酸化的磺基转移酶，GalNAc 是脊椎动物 CS/DS 中的主要硫酸化修饰结构。分析了他们的表型。引入C4ST-1特异性反义吗啉寡核苷酸的斑马鱼胚胎（C4ST-1 morphants）表现出形态异常，其中体轴和尾部弯曲或扭曲。我们在受精后48小时从C4ST-1 morphant中制备了糖胺聚糖糖链部分，并分析了CS/DS的二糖组成，第4位硫酸化的二糖的比例显着降低。因此，强烈表明在C4ST-1 morphant中观察到的形态异常是由CS/DS链中GalNAc的4位硫酸化减少或由CS/DS的结构变化引起的。 (2)前期研究表明CS/DS杂化糖链具有促进神经突生长的作用，并与多种生长因子具有较强的结合亲和力。然而，尚不清楚这种功能性 DS 结构聚糖在哺乳动物大脑的哪些区域表达。因此，我们通过原位杂交研究了小鼠出生后发育阶段磺基转移酶的表达，并利用脑切片分析了CS/DS的二糖组成。结果，我们发现在各种磺基转移酶中，参与DS链生物合成的两类磺基转移酶（D4ST-1和UST）在小脑中强烈表达。二糖组成分析还表明，小脑比其他区域含有更多 DS 特征的二糖单元。因此，有人认为DS链深入参与小脑神经网络的形成。