結晶構造解析と蛋白質工学による好アルカリ性アミラーゼ系酵素の活性発現機構の解明

通过晶体结构分析和蛋白质工程阐明嗜碱淀粉酶的活性表达机制

基本信息

批准号：
04J12015
负责人：
金井隆太
金额：
$ 1.47万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

広範囲なpH領域(5.5-11)で活性を示すシクロデキストリン合成酵素(CGTase)について、pH依存性の変化を示す変異型酵素R227Q-,K232Q-,H327N-,D371N-,R375Q-CGTaseの単独構造、阻害剤アカボース複合体の結晶構造をそれぞれ決定した。このうち、R227Q-,H327N-CGTaseでは、触媒残基側鎖の配向が変化しており、本酵素においてArg227,His327は触媒残基構造を形成することに直接関わり、その構造が広範囲なpH領域での活性維持に重要であることが推定された。そのほかの変異型酵素では触媒残基自体の構造は野生型に比べて変化していなかったことから、Lys232,Asp371,Arg375は触媒残基の構造形成に関わっていないが、静電的に触媒残基のプロトンの解離/結合状態に影響している、と考えられた。好アルカリ性マルトヘキサオース(G6)生成アミラーゼについて、そのG6複合体とG5複合体の結晶構造を決定した。その結果、G6は結合部位サブサイト-7から-2に結合し、G5はサブサイト-6から-2に結合していることが明らかになった。このことは本酵素が他のα-アミラーゼと異なり、そのような非生産的結合によってG6分解が抑制されていることを示唆している。特にサブサイト-6から-4のLys72,Trp140,Asp166が非生産的結合に重要であると推定された。そこで、Trp140をロイシン、チロシンに置換してそれぞれ活性測定を行ったところ、ロイシン変異はマルトヘキサオース生成が大きく減少し、チロシン変異でも、マルトヘキサオース生成が大きく減少し、マルトペンタオース生成が上昇していた。このことは特定のサブサイトでの芳香族アミノ酸のスタック相互作用によって、生成物がコントロールされていることを示している。

突变酶 R227Q-、K232Q-、H327N-、D371N- 和 R375Q-CGTase 的各个结构显示出环糊精合酶 (CGTase) 的 pH 依赖性变化，该酶在较宽的 pH 范围 (5.5-11) 中表现出活性，晶体。分别确定了抑制剂阿卡波糖复合物的结构。其中，在R227Q-,H327N-CGTase中，催化残基侧链的方向发生了变化，并且在该酶中，Arg227和His327直接参与形成催化残基结构，并且该结构可以分布在很宽的pH范围内推测其对于维持的活性很重要。在其他突变酶中，与野生型相比，催化残基本身的结构没有改变，因此Lys232、Asp371和Arg375不参与催化残基的结构形成，但它们被静电影响。该基团质子的解离/键合状态。测定了产生嗜碱麦芽六糖(G6)的淀粉酶的G6和G5复合物的晶体结构。结果显示G6与结合位点-7至-2亚位点结合，G5与-6至-2亚位点结合。这表明该酶与其他 α-淀粉酶的不同之处在于 G6 降解受到这种非生产性结合的抑制。特别是，子位点 -6 至 -4 中的 Lys72、Trp140 和 Asp166 估计对于非生产性结合很重要。因此，我们用亮氨酸和酪氨酸取代了Trp140并测量了它们的活性，发现亮氨酸突变显着降低了麦芽六糖的产量，而酪氨酸突变也显着降低了麦芽六糖的产量并增加了麦芽五糖的产量。这表明产物是通过特定亚位点芳香族氨基酸的堆积相互作用控制的。