ミトコンドリア・プレ配列レセプターTom20によるプレ配列認識の構造的基盤

线粒体前序列受体 Tom20 前序列识别的结构基础

• 批准号: 04J06414
• 负责人: 帯田 孝之
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J06414/
• 关键词: NMR; X線結晶構造解析; Tom20; プレ配列ペプチド; ミトコンドリア; 核磁気共鳴

ミトコンドリアのマトリックスタンパク質は細胞質で合成された後、ミトコンドリアに輸入される。ミトコンドリアには輸送を司るタンパク質複合体が存在し、なかでもTom20は外膜上に存在してプレ配列に最初に結合する受容体として機能している。このTom20分子による詳細なプレ配列認識機構を解析するために、NMR構造をもとにフレキシブルなN末端とC末端を除いたコア構造に対応するTom20coreを作製し、X線結晶構造解析を行った。Tom20coreとプレ配列(アルコール脱水素酵素由来: ALDH)との結合は弱いため、プレ配列のC末端に人為的に導入したシステインを介してSS結合を形成させたTom20core-プレ配列複合体の結晶化を行った。Tom20coreは大腸菌BL21(DE3)を用いて発現させ、GS4Bカラムにより精製した。ALDHプレ配列はペプチド合成し、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。Tom20coreとALDHプレ配列をpH8.0にて混合後、一晩室温に静置することによりSS結合を形成させた。その際に、リンカー部の配列を変えることにより、2つの異なる結晶系で結晶を得ることが出来た。一つは、YAGCリンカーで2.1Åの反射データ(空間群:C2、非対称単位中に7分子)を得た。もう一方は、AAGCリンカーで1.9Åの反射データ(空間群:P21、非対称単位中に2分子)を得ることに成功した。YAGCリンカー結晶中、及びAAGCリンカー結晶中でTom20core部分はほぼ同一の構造であった(rmsd<2.5Å)。Tom20に認識される部分のペプチド配列(R14LSRLL19)はαヘリックス構造をとることがわかった。

线粒体基质蛋白在细胞质中合成，然后输入线粒体中。线粒体含有控制运输的蛋白质复合物，其中Tom20存在于外膜上，作为首先与前序列结合的受体发挥作用。为了分析该Tom20分子的详细前序识别机制，我们根据NMR结构创建了对应于除去柔性N端和C端的核心结构的Tom20core，并进行了X射线晶体结构分析。由于Tom20core和前序列（源自乙醇脱氢酶：ALDH）之间的键很弱，因此我在前序列的C末端人工引入了半胱氨酸，从而形成了Tom20core-前序列复合物的结晶。 Tom20core 使用大肠杆菌 BL21(DE3) 表达并使用 GS4B 柱纯化。 ALDH 前序列是肽合成的，并通过反相柱色谱纯化。在 pH 8.0 下混合 Tom20core 和 ALDH 预序列后，在室温下静置过夜形成 SS 键。当时，通过改变连接部分的排列，他们能够获得具有两种不同晶系的晶体。其中之一是使用 YAGC 连接器获得的 2.1 Å（空间群：C2，不对称单元中的 7 个分子）的反射数据。另一方面，我们使用 AAGC 连接器成功获得了 1.9 Å 反射数据（空间群：P21，不对称单元中的 2 个分子）。 YAGC连接晶体和AAGC连接晶体中的Tom20核心部分具有几乎相同的结构（rmsd<2.5 Å）。发现Tom20识别的肽序列(R14LSRLL19)具有α-螺旋结构。