非平衡キャピラリー電気泳動法を用いた新規人工核酸アプタマーの創製

利用非平衡毛细管电泳创建新型人工核酸适体

基本信息

批准号：
11J10396
负责人：
笠原勇矢
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでにCE-SELEXによって創製したキメラ型アプタマーは、標的分子であるヒトトロンビンに対して高い親和性と優れた特異性を持っており、ピト血清中での安定性も向上していることがわかった。さらには, プライマー部位に導入した架橋型核酸を天然型に置換することで活性が大きく変化する特性を持っていた。そこで本年度では、得られた高親和性キメラ型アプタマーの予想される2次構造を元に、プライマー部位に導入した各架橋型核酸の結合親和性への寄与を検証した。プライマー部位の架橋型核酸を1残基ずつ天然型に置換した変異体を作製し標的分子に対する結合親和性を評価したところ、ステム構造の両端に位置する架橋型核酸を天然型に置換した場合に結合親和性が著しく低下することがわかった。また、種々の標的分子に対応できる一般性の高い入工核酸アプタマーのスクリーニング・システムの構築を目指して、既存の一般的手法では創製が困難だった標的分子に対する人工核酸アプタマーの取得を検討した。異なるデザインの人工核酸ライブラリを用いて、7～8ラウンドのセレクションを行うことで活性種の濃縮を行い、標的分子に特異的に結合する配列の選定に成功した。さらに、低分子に対してもスクリーニング可能にするため、分離条件の最適化を検討した。一般的に、標的分子が低分子の際は、非平衡キャピラリー電気泳動(NECEEM)では泳動度にほとんど変化が現れないため活性種の効率的な取得は困難だった。そこで、当研究室で既に創製された低分子結合性人工核酸アプタマーと標的分子で抗癌剤であるカンプトテシン誘導体を用いて複合体ピークをNECEEMによって分離可能かどうか検討した。その結果、測定条件を最適化することにより複合体ピークを穣認することができた。また、標的分子の濃度に依存して複合体ピークが変化することも確認でき、結合親和性を評価することができた。

迄今为止，CE-SELEX 构建的嵌合适体对目标分子人凝血酶具有高亲和力和优异的特异性，并且已被证明在 Pito 血清中具有改善的稳定性。此外，通过用天然型替换引入引物位点的交联核酸，可以显着改变活性。因此，今年，我们根据所获得的高亲和力嵌合适体的预测二级结构，验证了引入引物位点的每个交联核酸对结合亲和力的贡献。当我们创建一个突变体，其中引物位点中的交联核酸的每个残基都被天然类型取代并评估与靶分子的结合亲和力时，我们发现当交联核酸位于茎结构的两端时替换为天然型，发现结合亲和力显着降低。此外，为了构建可应用于多种靶分子的高度通用的工程化核酸适体的筛选系统，我们研究了针对使用现有通用方法难以创建的靶分子的人工核酸适体的获取。他们利用不同设计的人工核酸文库，通过七到八轮的选择富集了活性物种，并成功地选择了与目标分子特异性结合的序列。此外，为了能够筛选小分子，我们研究了分离条件的优化。通常，当目标分子是小分子时，由于非平衡毛细管电泳（NECEEM）中的电泳迁移率几乎没有变化，因此很难有效地获得活性物种。因此，我们研究了NECEEM是否可以使用我们实验室已经创建的小分子结合人工核酸适体和作为目标分子和抗癌药物的喜树碱衍生物来分离复杂的峰。结果，我们能够通过优化测量条件来清楚地识别复杂峰。还证实了复合物峰根据目标分子的浓度而变化，使得可以评估结合亲和力。