モーター分子KIF1Aの分子遺伝学的研究

运动分子KIF1A的分子遗传学研究

基本信息

批准号：
04F04658
负责人：
廣川信隆
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04F04658/
关键词：
モーター分子キネシン KIF1A ジーンターゲテイングハイポモルフ

项目摘要

細胞内の多種類のオルガネラはこれらのモーター分子によって各々決められた場所へ輸送されていると考えられる。この機構を解明することは細胞生物学における非常に重要な課題である。私はそのための有力な方法のひとつとして、ジーンターゲテイング法を用いて変異マウスを作製し、得られたマウスを細胞生物的手法によって解析している。神経系に特異に発現するユニークなモノマー型順方向性モーター分子KIF1A遺伝子欠損マウスは、生後24時間以内に全て死亡したことが、これまでの我々の研究室の従来型のノックアウトの結果より明らかになっている。これらの遺伝子の機能をさらに発生・分化が進んだ段階の組織・細胞において解析するために、KIF1Aハイポモルフマウスを作成し、その解析することを通じて、KIF1Aの生体内での機能についての知見を得ようと試している。KIF1AのPH domainはトランスファーベクターに挿入し、組み替え得たウイルスを増幅して培養細胞に感染させ、KIF1Aの抗原を大量に産生させました。さらに抗体の精製を完成し、精製した抗体を用い、免疫沈降実験を行った。沈降した物質中に、Trkという神経栄養因子神経細胞での物質輸送のカーゴ分子の一つと考えられる。培養細胞では、TrkとKIF1Aのcolocalizationも発現した。TrkがDRGの細胞内に存在している、KIF1Aハイポモルフマウスは、功能障害のため、DRGの細胞が死になった。さらに、死にそうな細胞の中で、Trk抗体で染まるものがたまっていることも発現した。電子顕微鏡でたまっているものをはっきり観察した。Trk signalの下流であるリン酸化Erkとリン酸化Aktはsignalが弱くなった。今はモーター分子とカーゴ分子に蛍光蛋白を融合させ神経細胞にウィルスを用いて遺伝子導入し、モーター分子とcargoの動態を解析している。

人们认为细胞内各种类型的细胞器通过这些运动分子运输到特定位置。阐明这一机制是细胞生物学中一个非常重要的问题。为此目的，一种有前途的方法是使用基因靶向方法创建突变小鼠，并使用细胞生物学技术分析所得小鼠。我们实验室此前的常规敲除结果显示，缺乏KIF1A基因（一种在神经系统中特异性表达的独特单体顺行运动分子）的小鼠，全部在出生后24小时内死亡。为了分析这些基因在发育和分化的更高级阶段的组织和细胞中的功能，我们创建了 KIF1A 亚型小鼠，通过它们的分析，我们获得了有关我正在尝试的 KIF1A 体内功能的知识。将KIF1A的PH结构域插入转移载体中，扩增重组病毒，感染培养细胞，产生大量KIF1A抗原。此外，我们完成了抗体的纯化，并使用纯化的抗体进行了免疫沉淀实验。沉淀的物质含有一种称为 Trk 的神经营养因子，它被认为是神经细胞中物质运输的货物分子之一。培养的细胞还表达 Trk 和 KIF1A 的共定位。在 KIF1A 亚型小鼠中，Trk 存在于 DRG 细胞中，DRG 细胞因功能障碍而死亡。此外，还发现被 Trk 抗体染色的细胞在即将死亡的细胞中积聚。使用电子显微镜清楚地观察到积累的材料。 Trk信号下游的磷酸化Erk和磷酸化Akt信号变弱。目前，我们正在通过将荧光蛋白与运动分子和货物分子融合并使用病毒将基因引入神经细胞来分析运动分子和货物的动力学。