アミノアシルtRNA合成酵素を用いた非天然型アミノ酸の蛋白質への導入と実用化

使用氨酰-tRNA 合成酶将非天然氨基酸引入蛋白质并在其中实际应用

基本信息

批准号：
04J11009
负责人：
小林隆嗣
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)を改変して,非天然型アミノ酸を特異的に認識させようとする場合に,aaRSの基質結合部位の詳細な構造情報が,改変戦略の鍵となる.本研究では,メタン生成古細菌において新しく発見されたaaRSである,ピロリジルtRNA合成酵素(PylRS)を改変して,翻訳後修飾でつくられるリジン修飾体を,翻訳段階で部位特異的にタンパク質に導入する研究を行った.まず,動物細胞において,PylRSとアンバーサプレッサーtRNAであるtRNA^<Pyl>の組み合わせが,内在性aaRS・tRNAとは相互作用せず,アンバーコドン特異的な非天然型アミノ酸の導入に用いることができることを見出した.その際に,動物細胞における配列非依存的なtRNA発現法を開発した.PylRSは,tRNA^<Pyl>へ,元の基質であるピロリジンもしくは人工的なアミノ酸であるBoc-リジンを結合させる活性をもつ.大腸菌において,PylRS変異体を発現させたときに,あるリジン誘導体がtRNA^<Pyl>へと結合されたかどうかを検出する方法を確立した.野生型のPylRSでは,in vitro転写tRNA^<Pyl>に対しては十分に高い活性を有していたが,大腸菌内におけるサプレッション効率はとても低く,スクリーニングには不十分であった.そこで,ランダム変異をPylRSに導入し,サプレッション効率が向上した変異体をスクリーニングしたところ,リジン誘導体特異的PylRS変異体をスクリーニングするのに十分な基本的活性をもつ酵素が得られた.そのほかに,3-ヨードチロシンを認識する大腸菌TyrRS変異体と各基質との立体構造解析を進め,変異残基の役割を詳細に明らかにした.

当试图修饰氨酰-tRNA合成酶（aaRS）以特异性识别非天然氨基酸时，aaRS底物结合位点的详细结构信息是修饰策略的关键，这是产甲烷古菌中新发现的aaRS。我们通过修饰琥珀抑制 tRNA 合成酶（PylRS），在翻译阶段将翻译后修饰产生的赖氨酸修饰产物定点引入到蛋白质中。首先，我们研究了 PylRS 与琥珀抑制 tRNA 在动物细胞中的结合。 tRNA^<Pyl> 是我们发现它不与内源aaRS/tRNA相互作用，可用于引入琥珀密码子特异性非天然氨基酸。此时，我们开发了一种在动物细胞中的序列无关的tRNA表达方法，PylRS是tRNA的原始底物。 ^<Pyl>具有结合吡咯烷或人工氨基酸Boc-赖氨酸的活性。一种在大肠杆菌中表达PylRS突变体时检测某种赖氨酸衍生物是否与tRNA^<Pyl>结合的方法在野生型PylRS中，虽然它对体外转录的tRNA^<Pyl>具有足够高的活性，但在大肠杆菌中的抑制效率非常低，不足以用于筛选。因此，我们在PylRS中引入随机突变，筛选具有提高抑制效率的突变体结果，我们获得了具有足够基本活性的酶来筛选赖氨酸衍生物特异性PylRS突变体。此外，我们研究了识别3-碘酪氨酸和每种底物的大肠杆菌TyrRS突变体的三维结构。详细分析并阐明了突变残基的作用。