微生物におけるエネルギー代謝酵素の進化と構造機能相関解析

微生物能量代谢酶的进化及构效关系分析

基本信息

批准号：
15780212
负责人：
河井重幸
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、種々の細菌由来NADキナーゼのリン酸受容体特異性について明らかにし、NADキナーゼ(NADに特異的)とNADHキナーゼ(NADとNADHに作用)の存在を実証した。さらに、これまでに本研究助成で決定したNADキナーゼの立体構造情報に基づいて、NADキナーゼにおけるリン酸受容体特異性を規定する構造特性を明らかにすると共に、NADキナーゼをNADHキナーゼに分子転換する手法の構築を試みた。すなわち、NADHとNADは、ニコチンアミド環において異なるため、NADのニコチンアミド環近傍のアミノ酸残基に注目した結果、1アミノ酸残基の置換により、NADキナーゼをNADHキナーゼに機能変換することに成功した。更に詳細な解析により、NADキナーゼとNADHキナーゼのリン酸受容体特異性の違いを規定する構造要因(アミノ酸残基)に関する知見を得た。尚、本研究で着目した部位に存在するアミノ酸残基は、207個のNADキナーゼホモログー次構造において、生物種特異的に保存されていることも見出した。一方、古細菌Methanococcus jannaschii由来NADキナーゼMJ0917に着目することにより、NADP分解系並びにNAD/NADP比の制御機構に関して新しい知見を得た。精製MJ0917タンパク質は、NADキナーゼ活性の他に、フルクトース-1,6-二リン酸、NADPH、そして特にNADPに対して強いフォスファターゼ活性を示すことを実証し、MJ0917がNADPaseとNADキナーゼの融合タンパク質として機能し得ることを示した。NADPの生合成と分解という相反する活性を持ちながらも、本酵素は生体内NAD/NADP比の調節を可能にする巧妙な生化学的特徴を備えていることも明らかにした。更にこれらの知見は、他のI-1-PaseホモログもNADPaseである可能性をも示した。

在本研究中，我们阐明了各种细菌NAD激酶的磷酸盐受体特异性，并证明了NAD激酶（对NAD具有特异性）和NADH激酶（作用于NAD和NADH）的存在。此外，基于迄今为止通过本研究资助确定的NAD激酶的三维结构信息，我们将阐明定义NAD激酶的磷酸受体特异性的结构特征，并致力于将NAD激酶分子转化为NADH激酶。制定一种方法。换句话说，由于NADH和NAD的烟酰胺环不同，他们把目光集中在NAD烟酰胺环附近的氨基酸残基上，通过替换一个氨基酸残基，成功地将NAD激酶功能性地转化为NADH激酶。通过更详细的分析，我们了解了决定 NAD 激酶和 NADH 激酶之间磷酸受体特异性差异的结构因素（氨基酸残基）。我们还发现，本研究重点关注的位点上存在的氨基酸残基在 207 NAD 激酶同源物的二级结构中具有物种特异性保守。另一方面，通过关注源自古菌詹氏甲烷球菌的NAD激酶MJ0917，我们获得了关于NADP降解系统和NAD/NADP比值控制机制的新知识。我们证明，除了 NAD 激酶活性外，纯化的 MJ0917 蛋白还对 1,6-二磷酸果糖、NADPH，尤其是 NADP 表现出强磷酸酶活性，这表明 MJ0917 作为 NADP 酶和 NAD 激酶的融合蛋白。可以工作。尽管该酶具有矛盾的生物合成和降解NADP活性，但也揭示了该酶具有巧妙的生化特征，使其能够在体内调节NAD/NADP比率。此外，这些发现还表明其他 I-1-Pase 同源物也可能是 NADPase。