植物テルペン合成系遺伝子のオルガネラ特異的発現による物質生産と生理機能の改変

通过植物萜烯合成基因的细胞器特异性表达来改变物质生产和生理功能

• 批准号: 15780068
• 负责人: 岡田 憲典
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780068/
• 关键词: テルペノイド; イソペンテニル2リン酸; ジメチルアリル2リン酸; メバロン酸経路; メチルエリスリトールリン酸経路; ユビキノン

本年度は、シロイヌナズナの2種のイソペンテニル2リン酸(IPP)イソメラーゼ遺伝子(AtIPP1,AtIPP2)の変異体である、atipp1破壊株とatipp2破壊株のタンパクレベルでの欠失を確認するため、AtIPP2ポリクローナル抗体を用いたウエスタン解析を進めた。野生株とそれぞれの変異体の根、ロゼット葉、茎生葉、茎、花芽、鞘より粗タンパク質を抽出しウエスタンブロッティングに供したところ、野生株の根において30kDa付近に現れる近接した2つのバンドが検出された。また、このバンドのそれぞれ一方がAtIPP1、AtIPP2に対応していることが、各変異体においてバンドの片方のみが消失することから明らかとなった。しかしながら、これら単独破壊株では何ら表現型が見られないことから、それぞれの変異体の掛け合わせによるatipp1/atipp2二重破壊株を作成した。その結果、二重破壊株では発芽時からクロロフィル色素の低下による白化が見られたが、完全に色素合成能を失ってはいなかった。このことから、AtIPP1とAtIPP2は互いに機能相補しており、その酵素機能であるIPPとジメチルアリル2リン酸(DMAPP)との異性化が、細胞質のメバロン酸経路のみならず、メチルエリスリトールリン酸(MEP)経路が働くプラスチドでのテルペノイド合成にも部分的に必要であることが示された。さらに、MEP経路と本酵素の関与を追究するため、MEP経路の最終段階においてIPPとDMAPPの両方の供給を担うAtLYTB遺伝子のプロモーター領域にT-DNAが挿入されたatlytb変異体を用いた解析を行った。本変異体はMEP経路由来のIPP、DMAPPが不足するため、弱い白化形質を示す。ミトコンドリアに局在が確認されたAtIPP2をatlytb変異体で発現させたところ、この白化形質が完全に相補されたのに対し、細胞質型と考えられるAtIPP1を発現させた場合には白化形質が強まる傾向が見られた。これらの結果は、atlytb変異体において不足したプラスチド内のIPPあるいはDMAPPが、AtIPP2の高発現により供給され、またAtIPP1の発現ではさらに減少することを示唆している。今後、atlytb変異体相補に寄与したIPP, DMAPPがメバロン酸経路とMEP経路のどちらから供給されたのかを突き止めることで、IPPイソメラーゼの本来の役割を明らかにして行く。

今年，为了确认 atipp1 和 atipp2 破坏菌株（这两个拟南芥异戊烯基二磷酸（IPP）异构酶基因（AtIPP1、AtIPP2）突变体）中蛋白质水平的缺失，我们构建了 AtIPP2 多克隆。抗体。从野生型菌株和各突变体的根、莲座叶、茎叶、茎、花蕾和鞘中提取粗蛋白并进行Western blotting，在根中检测到两条紧密排列的条带，其位置在30 kDa左右。野生型菌株就完成了。此外，还发现这些条带之一对应于 AtIPP1 和 AtIPP2，因为每个突变体中只有一条条带消失。然而，由于在这些单破坏菌株中没有观察到表型，我们通过杂交每个突变体创建了 atipp1/atipp2 双破坏菌株。结果，双破坏菌株由于从发芽时起叶绿素色素减少而表现出变白，但并没有完全丧失合成色素的能力。这表明AtIPP1和AtIPP2在功能上彼此互补，并且它们的IPP异构化为二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的酶功能不仅限于细胞质甲羟戊酸途径，还显示为甲基赤藓糖醇磷酸(DMAPP)。部分需要在质体中合成，MEP 途径在质体中发挥作用。此外，为了研究该酶在 MEP 途径中的参与，我们使用 atlytb 突变体进行了分析，其中 T-DNA 插入 AtLYTB 基因的启动子区域，该基因负责在细胞中提供 IPP 和 DMAPP MEP 路径的最后一步已经完成。该突变体表现出弱白化病，因为它缺乏源自 MEP 途径的 IPP 和 DMAPP。当AtIPP2（已被证实位于线粒体中）在atlytb突变体中表达时，这种美白特性得到了完全补充，而当AtIPP1（被认为是细胞质型）表达时，美白特性趋于更强被看见了。这些结果表明，atlytb突变体中缺乏的质体中的IPP或DMAPP是由AtIPP2的高表达提供的，并且通过AtIPP1的表达进一步减少。今后，我们将通过确定有助于atlytb突变体互补的IPP和DMAPP是否由甲羟戊酸途径或MEP途径提供来阐明IPP异构酶的原始作用。