タンパク質複合体形成を利用したカルモジュリン依存性キナーゼの結晶化と構造研究

利用蛋白质复合物形成对钙调蛋白依赖性激酶进行结晶和结构研究

基本信息

批准号：
15770071
负责人：
柴田直樹
金额：
$ 1.54万
依托单位：
University of Hyogo (2004)Himeji Institute of Technology (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770071/
关键词：
カルモジュリンキナーゼ結晶化 X線結晶構造解析法

项目摘要

カルシウムイオン/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼα(CaMKKα)の構造解析を目指して、CaMKKαと抗体(IgG)または抗体フラグメント(Fabフラグメント)及びカルモジュリンとの複合体試料を用いて結晶化を行った。CaMKKαについては完全長のものとFactor XaでフレキシブルなN末端領域を切断した試料とを用いて実験を行った。互いに異なる単クローン抗体を産出する2種類のハイブリドーマを用いてマウス腹水から抗CaMKKα IgGを得た。これを硫安分画とイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。Fabフラグメントは精製されたIgGをパパイン処理することによって得られた。抗体との複合体調製のため、CaMKKα試料をIgGまたはFabと混合し、それを結晶化サンプルとした。結晶化スクリーニングは主に市販のスクリーニングキット10種類を用いて行った。カルモジュリンとの複合体試料とATPアナログとの複合体試料についても同様にスクリーニングを行った。IgGを用いた場合CaMKKα単独では結晶が得られなかった条件でも針状結晶が得られた。しかし、これらはX線回折実験には適さない物であった。また、Fabを用いた場合でも同様の針状結晶が得られた他、沈澱剤として硫酸アンモニウムを用いた場合に板状結晶が得られた。SPring-8での回折実験では回折点を確認することが出来なかった。

为了分析钙离子/钙调蛋白依赖性激酶激酶α（CaMKKα）的结构，我们使用CaMKKα、抗体（IgG）或抗体片段（Fab片段）和钙调蛋白的复合样品进行结晶。对于CaMKKα，使用全长样品和柔性N末端区域被因子Xa切割的样品进行实验。使用产生不同单克隆抗体的两种类型的杂交瘤从小鼠腹水中获得抗 CaMKKα IgG。将其通过硫酸铵分级分离和离子交换色谱法纯化。通过用木瓜蛋白酶处理纯化的 IgG 获得 Fab 片段。为了制备与抗体的复合物，CaMKKα样品与IgG或Fab混合并用作结晶样品。结晶筛选主要使用10种市售筛选试剂盒进行。还以相同的方式筛选含有钙调蛋白的复合物样品和含有ATP类似物的复合物样品。当使用IgG时，即使在仅用CaMKKα无法获得晶体的条件下也获得了针状晶体。然而，这些不适合X射线衍射实验。另外，当使用Fab时得到类似的针状晶体，而当使用硫酸铵作为沉淀剂时得到板状晶体。在SPring-8的衍射实验中，无法确认衍射点。