ヘパラン硫酸の特異的硫酸化による細胞間シグナル系の調節機構

硫酸乙酰肝素特异性硫酸化对细胞间信号系统的调节机制

• 批准号: 03J01321
• 负责人: 神村 圭亮
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Aichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J01321/
• 关键词: ヘパラン硫酸; 硫酸転移酵素; FGF; ショウジョウバエ; シグナル伝達; 発生

ヘパラン硫酸は細胞増殖因子、プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子など極めて多様な分子と相互作用する事により、様々な生物学的活性を示す。この多彩な機能は、「異なる硫酸化パターンを持つヘパラン硫酸が、それぞれ異なるタンパク質と結合し、シグナルの特異性を決定する。」ことから生じると考えられている。異なる部位の硫酸化は、それぞれ異なるヘパラン硫酸転移酵素(N,2-O,6-O,3-O硫酸転移酵素)により触媒される。しかしヘパラン硫酸に関するこれまでの解析はin vitroでの研究が主流を占めていたため、個体発生における機能に関しては未だはっきりしていない。そこで私は遺伝学的手法が有効なショウジョウバエを用いて2-O及び6-O硫酸転移酵素(Hs2st及びHs6st)に注目し機能解析を行なった。まずはじめにHs2st及びHs6st遺伝子の完全欠失変異体を単離した。次にこれらの遺伝子の組織におけるmRNAの発現を調べたところ、Hs2stは多くの組織で一様に発現し、Hs6stは気管前駆細胞において強く発現しているが判明した。ショウジョウバエの気管形成はFGFシグナルに大きく依存することが知られているため、Hs2st及びHs6st遺伝子の気管形成における機能について調べた。意外な事にHs2st及びHs6st変異体では多くの個体で気管が正常に発生した。これらの変異体におけるヘパラン硫酸の構造をHPLCを用いて調べたところ、Hs2st変異体では6-O硫酸基が、Hs6st変異体では2-O硫酸基が増加し、その結果変異体における全体の硫酸基量は野生型と比べて全く変化していないことが分かった(硫酸基量補償機構)。個体内での硫酸基量の維持が発生過程においてどのような重要性を持つのか明らかにするため、次にHs2st ; Hs6st二重変異及び分泌性6-O脱硫酸化酵素の発現が気管形成に与える影響について調べた。Hs2st ; Hs6stでは気管が全く形成されず、FGF依存性MAPKの活性化が著しく低下した。この結果は2-Oと6-O硫酸化ヘパラン硫酸はFGFシグナルにおいて重複した機能を持つ事を示す。また、分泌性6-O脱硫酸化酵素遺伝子発現個体では6-O硫酸基が著しく減少し、他の硫酸基の増加は認められない。その結果全体の硫酸基量は野生型の70%程度にまで減少する。非常に興味深い事にこの個体はHs6st変異体より高い致死率を示し、強い気管の形態異常を示した。以上の結果から、ショウジョウバエのFGFシグナル活性化において、厳密な硫酸化パターンよりむしろ硫酸基量が重要な働きをすることが示唆された。

硫酸乙酰肝素通过与细胞生长因子、蛋白酶和细胞外基质分子等多种分子相互作用而表现出多种生物活性。这种多种功能被认为是由于“具有不同硫酸化模式的硫酸乙酰肝素与不同的蛋白质结合，决定了信号的特异性”。不同位点的硫酸化由不同的乙酰肝素磺基转移酶（N,2-O,6-O,3-O 磺基转移酶）催化。然而，迄今为止，大多数硫酸乙酰肝素的分析都是体外研究，其在个体发育中的功能仍不清楚。因此，我重点研究了2-O和6-O磺基转移酶（Hs2st和Hs6st），并利用遗传方法有效的果蝇进行了功能分析。首先，我们分离出 Hs2st 和 Hs6st 基因的完全缺失突变体。接下来，我们研究了这些基因的组织mRNA表达，发现Hs2st在许多组织中均匀表达，而Hs6st在气管祖细胞中强表达。由于已知果蝇气管形成高度依赖于 FGF 信号，我们研究了 Hs2st 和 Hs6st 基因在气管形成中的功能。令人惊讶的是，许多 Hs2st 和 Hs6st 突变体的气管发育正常。当使用 HPLC 研究这些突变体中硫酸乙酰肝素的结构时，Hs2st 突变体中 6-O 硫酸基团的数量增加，Hs6st 突变体中 2-O 硫酸基团的数量增加，导致总硫酸盐增加发现突变体中的碱基数量与野生型相比根本没有变化（硫酸基数量补偿机制）。为了阐明在发育过程中维持个体体内硫酸基数量的重要性，我们接下来研究了 Hs2st、Hs6st 双突变和分泌性 6-O 脱硫酶的表达对气管形成的影响。影响。在Hs2st和Hs6st中，没有形成气管，并且FGF依赖性MAPK激活显着减少。该结果表明 2-O 和 6-O 硫酸化硫酸乙酰肝素在 FGF 信号传导中具有重叠的功能。此外，在表达分泌型6-O脱硫酶基因的个体中，6-O硫酸基明显减少，而没有观察到其他硫酸基的增加。结果，硫酸根总量减少至野生型的约70%。有趣的是，该个体表现出比Hs6st突变体更高的死亡率，并且表现出强烈的气管形态异常。这些结果表明，硫酸基团的数量在果蝇 FGF 信号激活中起着重要作用，而不是确切的硫酸化模式。

项目成果

Regulation of Notch signaling by Drosophila heparan sulfate 3-O sulfotransferase.

果蝇硫酸乙酰肝素 3-O 磺基转移酶对 Notch 信号传导的调节。

• 发表时间: 2004
• 作者: Keisuke Kamimura et al.