ユビキチン付加部位変異p53の癌遺伝子治療への応用に関する基礎的研究

泛素添加位点突变体p53在癌症基因治疗中应用的基础研究

• 批准号: 14770100
• 负责人: 中村 誠一
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770100/
• 关键词: p53; ユビキチン; MDM2; 細胞周期制御; アポトーシス; 細胞周期調節

癌抑制遺伝子p53蛋白質は,MDM2を介する分解を受けるが,その際,p53にユビキチンが付加され,最終的にプロテアソームで分解される.ユビキチン付加部位の候補として,C末端領域のリシン残基が考えられる.370,372,373,381,380のリシン残基をアラニンに置換した変異p53を作製して,そのユビキチン化の程度,細胞に与える影響を解析した.これらのリシン残基を4つ以上変異したp53をMDM2発現プラスミドとともに,非小細胞肺癌細胞株(H1299)で発現させると,野生型p53とMDM2の共発現で認められるような,p53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められなかったことより,p53C末端領域のリシン残基が重要であることが示唆された.しかし,それぞれのリシン残基単独の突然変異では,MDM2との共発現でp53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められたことより,これらのリシン残基の中で,ユビキチン付加部位として単独のリシン残基を想定するよりも,複数のリシン残基が同時にユビキチン付加を受けることが,p53分解に重要であると考えられた.このリシン残基変異p53の消化器癌に対しての治療効果を検討するため,大腸癌細胞株(Colo201,LoVo,WiDr)を用いて,リシン残基p53発現プラスミドをトランスフェクションし,コロニー形成能に与える影響を検討した.しかしながら,十分な発現を得ることが困難であり,効率の良い遺伝子導入法が必要となった.そのため,リシン残基p53発現アデノウイルスを作製した.今後は,このアデノウイルスを用いて,消化器癌細胞への効果を検討する予定である.

抑癌基因p53蛋白经历MDM2介导的降解，在此过程中泛素被添加到p53上，最终被蛋白酶体降解。我们构建了p53突变体，其中370、372、373、381和380位的赖氨酸残基被丙氨酸取代，并分析了泛素化程度及其对细胞的影响。当具有四个或更多这些赖氨酸残基突变的 p53 与 MDM2 表达质粒一起在非小细胞肺癌细胞系 (H1299) 中表达时，p53 蛋白水平下降，如共表达野生型 p53 和 MDM2 时所观察到的没有观察到 p53 C 末端区域的赖氨酸残基很重要。由于在与DM2共表达时观察到p53蛋白水平的降低和泛素添加，因此发现在这些赖氨酸残基中，不是假设单个赖氨酸残基作为泛素附着位点，而是检测到多个赖氨酸残基。 p53的同时泛素化对于p53的降解很重要。为了检查这种赖氨酸残基突变的p53对胃肠癌的治疗作用，我们使用了结直肠癌细胞系(Colo20)。 1，LoVo，WiDr），我们转染了表达赖氨酸残基p53的质粒并检查了其对集落形成能力的影响，但是，很难获得足够的表达，并且没有有效的基因转移方法，因此我们创建了表达的腺病毒。赖氨酸残基p53。我们计划使用这种腺病毒来检查它对胃肠道癌细胞的作用。