好中球活性酸素発生系におけるp47phoxによる活性制御に関する構造生物学的研究

中性粒细胞活性氧系统p47phox活性调节的结构生物学研究

基本信息

批准号：
14780469
负责人：
小椋賢治
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780469/
关键词：
好中球活性酸素核磁気共鳴分光法 SH3ドメイン立体構造

项目摘要

今年度は,好中球活性酸素発生系p47phoxの自己阻害状態における立体構造解析をおこなった.p47phoxのタンデムSH3ドメインおよび自己阻害領域を含むコンストラクト(残基番号151から340)の結晶化をおこない,最終的に,PEG6000を沈殿剤として長さ0.35mmの単結晶を得た.Spring-8放射光施設のBL41XUビームラインを用いて,この結晶のX線回折像を取得した.セレノメチオニン変異体を用いたMAD法により,回折像の位相を決定したのち,CNSプログラムにより,最終的に分解能3.5Åの立体構造を得た.得られた立体構造は,βストランドを一部お互いに交換する形で,ダイマーを形成していた.生体内中では,p47phoxはモノマーとして挙動することが示されているので,この結晶構造は,結晶化の過程で生じたものと考えられる.このダイマーをそれぞれ単一のモジュールとして置換したものが生体内での立体構造を反映するものと推定した.この立体構造では,自己阻害領域のうちGAPPRと呼ばれる配列が,ポリプロリンII型ヘリックスを形成して,ふたつのSH3ドメインのp22結合部位と相互作用していた.さらに,自己阻害領域の多くの部分が,ふたつのSH3ドメインと強い相互作用を有していた.p47phoxは,自己阻害領域のセリンがリン酸化修飾を受けることで,自己阻害状態から活性化状態に移行することが知られているが,リン酸化修飾を受けると予想されているセリンは,SH3ドメインとのあいだの相互作用部位に位置していた.

今年，我们分析了中性粒细胞活性氧生成系统p47phox在自抑制状态下的三维结构。我们结晶了一个包含串联SH3结构域和p47phox自抑制区域的构建体（残基编号151至340），最后得到了单晶。使用PEG6000作为沉淀剂获得了长度为0.35mm的BL41XU，在Spring-8同步加速器辐射设施上。我们使用光束线获得了该晶体的 X 射线衍射图像。在使用硒代蛋氨酸突变体使用 MAD 方法确定衍射图像的相位后，我们最终使用 CNS 程序确定了分辨率为 3.5 Å 的三维结构。获得的三维结构通过彼此交换一些β链形成二聚体。在体内，p47phox表现为单体。因此，这种晶体结构被认为是在结晶过程中生成的。假设每个二聚体作为单个模块的取代反映了体内的三维结构，在这个三维结构中，有一个称为GAPPR的序列。自抑制区域形成聚脯氨酸 II 型螺旋并与两个 SH3 结构域的 p22 结合位点相互作用。此外，自抑制区域的许多部分与两个 SH3 结构域有很强的相互作用，已知丝氨酸在从活性状态到激活状态的转变过程中发生磷酸化。与SH3域的相互作用位点。