Elucidating the intracellular mechanisms of RNA interference by single molecule fluorescence microscopy and spectroscopy

通过单分子荧光显微镜和光谱学阐明 RNA 干扰的细胞内机制

• 批准号: 5392510
• 负责人: Professorin Dr. Petra Schwille
• 金额: --
• 依托单位: Forschungsgruppe Zelluläre und molekulare Biophysik
• 依托单位国家: 德国
• 项目类别: Priority Programmes
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 德国
• 起止时间: 2002-12-31 至 2010-12-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/5392510?language=en
• 关键词: Elucidating; intracellular; mechanisms; RNA; interference

Ziel dieses Projektes ist es, eine geeignete instrumentelle Plattform von neuen mikroskopischen und spektroskopischen Einzelmolekülmethoden zu schaffen, um in fundamentaler Weise zur Aufklärung des biochemischen Phänomens der zellulären RNA-Interferenz (RNAi) beizutragen. Unter RNA-Interferenz versteht man den erst kürzlich entdeckten posttranskriptionalen Regulationsmechanismus bei der Genexpression in verschiedenen Organismen. Die Anwesenheit kurzer doppelsträngiger RNA von 21-23 nt Länge (siRNA) bewirkt auf noch ungeklärte Weise, vermutlich durch Komplexierung mit verschiedenen zelleigenen Proteinen, den spezifischen Abbau der homologen mRNA und verhindert somit die Proteinproduktion. RNAi eignet sich für eine genomweite Analyse der Genfunktion in großem Maßstab und ist zeitsparender als herkömmliche Knock-out Technologien. Spektroskopische Einzelmolekülmethoden wie die von uns entwickelte FluoreszenzKreuzkorrelationsanalyse erlauben es in völlig neuartiger Weise, Dynamiken und molekulare Interaktionen verschiedener Moleküle und Molekülkomplexe in der lebenden Zelle zu verfolgen. Durch Kombination mit hochsensitiven bildgebenden Verfahren sollen diese Methoden eingesetzt werden, um die Bewegung der siRNAs durch die Zelle sowie ihre lokalen, spezifischen Interaktionen mit mRNA und Proteinen in Echtzeit zu untersuchen. Eine Aufklärung der einzelnen molekularen Schritte, die letztlich die Abschaltung der Genfunktion bewirken, kann im Idealfall zum Design besonders funktionaler siRNA-Assays führen, mit weitreichenden Konsequenzen für deren therapeutische Anwendung. Summary: Goal of this project is the establishment of an instrumental platform for novel microscopic and spectroscopic single molecule techniques to elucidate the molecular mechanisms of RNA interference. RNA interference is the process of post-transcriptional specific suppression of gene expression by short interfering RNA duplexes (siRNAs). Delivery of siRNAs to live mammalian cells has been shown to efficiently "knock-down" the expression of specific proteins, providing a fascinating new tool for studying gene function, but potentially also as gene-specific therapeutics. The molecular pathways of siRNAs from their delivery to specific interference of protein expression via mRNA degradation, supposedly by complexation with cellular proteins, are far from being understood. Single-molecule methods such as fluorescence cross-correlation spectroscopy previously developed by our group, are most powerful tools to study molecular interactions and dynamics in living cells. Their combination with ultrasensitive fluorescence imaging is thus a highly promising approach to follow not only the movement of siRNA once introduced to the cell, but also their specific local interactions with proteins and nucleic acids in real time. Identification of the individual steps in RNAi on a molecular level may eventually contribute to the development of improved siRNA duplexes, and may also provide insights into the selection of optimal target RNA structures or sequences.

RNA 干扰 (RNAi) 下。 RNA 干扰研究是生物体中基因表达的转录后调控机制。 RNAi 是用于对基因功能进行基因功能分析的 RNAi 基因，在 großem Maßstab 和 ist zeitsparender 中也适用于 Knock-out 技术。 Durch 组合 mit高灵敏度的技术解决了我们所采用的方法，即 siRNA 的研究，特别是在 Echtzeit zu untersuchen 中的 mRNA 和蛋白质相互作用。摘要：该项目的目标是建立一个新的显微和光谱单分子技术的仪器平台，以阐明 RNA 干扰的分子机制。通过短干扰RNA双链体(siRNA)对基因表达进行转录后特异性抑制已被证明可以有效地“敲低”特定蛋白质的表达，为研究基因功能提供了一种令人着迷的新工具。但 siRNA 从递送到通过 mRNA 降解（据称是通过与细胞蛋白质复合）特异性干扰蛋白质表达的分子途径还远未被了解。我们小组先前开发的互相关光谱是研究活细胞中分子相互作用和动力学的最强大工具，因此它们与超灵敏荧光成像的结合是一种非常有前途的方法，不仅可以跟踪 siRNA 引入细胞后的运动，还可以跟踪 siRNA 的运动。还可以在分子水平上实时识别它们与蛋白质和核酸的特定局部相互作用，最终可能有助于开发改进的 siRNA 双链体，并且还可以为选择最佳靶标 RNA 结构提供见解。或序列。