初代培養肝実質細胞の増殖に影響を及ぼすアドレナリン作動性調節機構に関する研究

影响原代培养肝实质细胞增殖的肾上腺素调节机制研究

基本信息

批准号：
14771291
负责人：
木村光利
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Josai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14771291/
关键词：
Hepatocytes Adrenoceptor agonist PI3-kinase P70S6 kinase Primary culture Growth factor Western blotting Cross-talk Hepatocyte proliferation MAP kinase Western blotting analysis

项目摘要

肝再生現象の仕組みの一端を解明する目的で、初代培養肝実質細胞系において、アドレナリン作動性α_1、α_2およびβ_2受容体応答が、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)や肝細胞増殖因子(HGF)などの各成長因子のシグナル伝達機構のどの部分と相互作用をしているのかを、MAPキナーゼ(MAPK)の上流と下流に位置していると推定されるフォスファチジールイノシトール3キナーゼ(PI3K)およびp70リボゾーマルS6キナーゼ(p70S6K)の活性を直接測定することにより検討した。その結果、1)PI3Kおよびp70S6K蛋白質の単離条件(細胞懸濁液、蛋白質分離条件など)、PI3K やp70S6Kのリン酸化体に対するモノクローナル抗体を一次抗体、HRP標識抗ウサギIgGを二次抗体として用いた非RI標識法によるウエスタンブロット解析の至適実験条件(標識用緩衝液および抗体の濃度など)を設定することができた。2)HGFとPDGFの各々の単独刺激により、培養開始5分でピークとなる一過性のPI3KおよびP70S6Kのリン酸化活性の増加が、各々発現したが、EGF刺激ではPI3Kの活性化を示さなかった。さらにPI3Kの活性は、特異的MEK阻害であるPD98059では抑制されず、PI3KがMAPKの上流に位置することが碓認できた。3)そして、EGFによるP70S6Kの活性化は、β_2作動薬の共存下で増強され、α_2作動薬で減弱された。PDGFによるPI3Kおよびp70S6Kの活性は、各々α_2およびβ_2作動薬の影響は受けず、α1作動薬でのみ増強された。さらにHGFにおいては、α_1およびβ_2作動薬の共存下で、ともに増強された。一方、α_1、α_2およびβ_2作動薬単独ではPI3Kおよびp70S6K活性に影響を与えなかった。これらの結果から、上記成長因子による増殖シグナルは受容体チロシンキナーの下流からPI3Kの上流付近で、それぞれの成長因子に特有なアドレナリン作動性調節を受けていることが示唆された。

为了阐明肝再生的部分机制，我们研究了原代培养的肝细胞中肾上腺素能α_1、α_2和β_2受体反应对表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）和肝细胞的影响细胞生长因子（HGF）等各生长因子的信号转导机制。磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K) 和 p70 核糖体 S6 激酶 (p70S6K) 的活性估计位于 MAP 激酶 (MAPK) 的上游和下游，可用于确定它们与身体的哪个部位相互作用。通过直接测量对此进行了研究。结果，1) PI3K 和 p70S6K 蛋白的分离条件（细胞悬浮液、蛋白分离条件等），使用针对 PI3K 和 p70S6K 磷酸化形式的单克隆抗体作为一抗，并使用 HRP 标记的抗兔 IgG 进行分离。我们能够设置使用非 RI 标记方法进行蛋白质印迹分析的最佳实验条件（标记缓冲液、抗体浓度等）。 2) HGF和PDGF的单一刺激导致PI3K和P70S6K磷酸化活性短暂增加，在培养开始后5分钟达到峰值，但EGF刺激没有显示PI3K的任何激活。此外，PI3K 活性并未被特异性 MEK 抑制剂 PD98059 抑制，证实 PI3K 位于 MAPK 的上游。 3) EGF 对 P70S6K 的激活在 β_2 激动剂存在下增强，而在 α_2 激动剂存在下减弱。 PDGF诱导的PI3K和p70S6K活性分别不受α_2和β_2激动剂的影响，并且仅被α1激动剂增强。此外，HGF 在 α_1 和 β_2 激动剂同时存在的情况下得到增强。另一方面，单独的α_1、α_2和β_2激动剂对PI3K和p70S6K活性没有影响。这些结果表明，来自上述生长因子的生长信号受到每种生长因子特有的肾上腺素能调节，从受体酪氨酸激酶的下游到PI3K的上游。