iPS細胞・間葉系幹細胞からの色素細胞と悪性黒色腫の作成と発現分子の臨床応用

iPS细胞/间充质干细胞制备色素细胞和恶性黑色素瘤及其表达分子的临床应用

• 批准号: 21659270
• 负责人: 河上 裕
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659270/
• 关键词: iPS細胞; 幹細胞; 色素細胞; 悪性黒色腫; 皮膚科学; iPS; メラノサイト

本研究では、最近蓄積されてきた色素細胞およびヒト悪性黒色腫形成の分子機構の知識を駆使して、in vitroでのiPSおよび間葉系幹細胞からの色素細胞(色素幹細胞)および悪性黒色腫細胞作成を目指した。最初にiPS細胞より色素細胞が誘導できるかを検証することにし、材料となるヒトiPS細胞を独自に樹立することにした。ヒト皮膚細胞よりiPS化に必要なリプログラム4因子(Sox2,Oct3/4,KLF4,MYC)およびMYCを除く3因子を用いて、iPS細胞株をそれぞれ樹立し、それらiPS細胞株における未分化マーカー(Nanog,SSEA4,TRA-1-60,TRA-1-81等)の発現を遺伝子発現解析や免疫組織化学的手法により検証するとともに、Oct3/4プロモーターの脱メチル化の状態をバイサルファイトシークエンス法により検証した。さらに、in vitroにおいて各iPS細胞株を分化させて、三胚葉系の細胞にそれぞれ分化することや免疫不全マウスにおけるテラトーマ形成能を確認した。これらの樹立したiPS細胞株を色素細胞に誘導するために、胚葉体を形成させたのち、Wnt3,SCF,ET3といった色素細胞分化誘導剤を含む分化誘導培地中で継体培養を行った。その結果、分化誘導後約2月で、色素顆粒を含む色素細胞への分化が確認できた。これらの細胞は、SILV,TYRP,TYR,S100といった代表的な色素細胞マーカーを発現していた。さらに、分化誘導された色素細胞の遺伝子発現プロファイルがヒト初代培養色素細胞と非常に高いことが、DNAマイクロアレイ解析により明らかになった。また、これらの色素細胞の分化誘導過程において、色素細胞の起源細胞である神経堤細胞や色素幹細胞が出現することも、それぞれのマーカー発現解析により明らかとなった。これらに加えて、色素幹細胞をレンチウィルスシステムを用いて濃縮することにも新たに成功した。さらに、神経堤細胞を高効率で選択的に誘導する系の確立にも新たに成功した。これらの技術を用いて、悪性黒色腫瘍幹細胞を人工的に作製する基盤を確立した。

在这项研究中，我们利用最近积累的色素细胞和人类恶性黑色素瘤形成的分子机制的知识，在体外从 iPS 和间充质干细胞中培养色素细胞（黑色素细胞）和恶性黑色素瘤细胞。首先，他们决定验证色素细胞是否可以源自iPS细胞，并决定独立建立人类iPS细胞作为材料。我们使用 4 个重编程因子（Sox2、Oct3/4、KLF4、MYC）和 MYC 以外的 3 个人类皮肤细胞 iPS 转化所需的因子建立了 iPS 细胞系，并确定了这些 iPS 细胞系中的未分化标记物（Nano）。 g、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81等）通过基因表达分析和免疫组化方法进行验证，并通过亚硫酸氢盐测序确定Oct3/4启动子的去甲基化状态进行验证。此外，我们在体外分化了每个 iPS 细胞系，并证实它们分化为三叶细胞，并且具有在免疫缺陷小鼠中形成畸胎瘤的能力。为了诱导这些建立的iPS细胞系变成色素细胞，形成胚状体，然后在含有色素细胞分化诱导剂如Wnt3、SCF和ET3的分化诱导培养基中传代培养。结果，在诱导分化后约两个月，确认分化为含有色素颗粒的色素细胞。这些细胞表达典型的色素细胞标记，例如 SILV、TYRP、TYR 和 S100。此外，DNA微阵列分析显示，分化色素细胞的基因表达谱远高于人类原代培养色素细胞。此外，通过标记表达分析表明，在诱导这些色素细胞分化的过程中，出现了作为色素细胞的起源细胞的神经嵴细胞和色素干细胞。除此之外，我们最近还成功地利用慢病毒系统富集了色素干细胞。此外，我们最近成功建立了一种高效选择性诱导神经嵴细胞的系统。利用这些技术，我们为人工生产恶性黑色素瘤干细胞奠定了基础。

项目成果

Generation of human melanocytes from iPS cells in vitro

体外从 iPS 细胞生成人类黑色素细胞

• 发表时间: 2010
• 作者: Ohta S;Imaizumi Y;Okada Y;Akamatsu W;Matsuzaki Y;Okano H;Kawakami Y.
• 通讯作者: Kawakami Y.

Generation of human melanocytes from induced pluripotent stem cells.

• DOI: 10.1007/978-1-62703-330-5_16
• 发表时间: 2013-01-01
• 期刊: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)
• 作者: Ohta, Shigeki;Imaizumi, Yoichi;Kawakami, Yutaka
• 通讯作者: Kawakami, Yutaka

悪性黒色腫に対する免疫応答と免疫療法-最近の進歩-

恶性黑色素瘤的免疫反应和免疫治疗 - 最新进展 -

• 发表时间: 2009
• 作者: Ohta S;Akamatsu W;Imaizumi Y;Okada Y;Matsuzaki Y;Okano H;Kawakami Y;太田訓正;河上裕
• 通讯作者: 河上裕