高IgE症候群モデルマウスの作製とその検討

高IgE综合征模型小鼠的建立及研究

基本信息

批准号：
21659253
负责人：
峯岸克行
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659253/
关键词：
原発性免疫不全症高IgE症候群モデルマウスノックインマウス

项目摘要

原発性免疫不全症は免疫系遺伝子の先天異常により発症する疾患で、ヒトの免疫系遺伝子の生体内機能の解明に大きな貢献をしてきた。高IgE症候群はその1つで黄色ブドウ球菌による皮膚・肺の感染症、アトピー性皮膚炎、血清IgEの高値を呈する。今回我々がその原因遺伝子を世界に先駆けて発見した高IgE症候群において、STAT3変異の病態形成機構を明らかにするために、STAT3のドミナントネガティブ変異体を発現するコンディショナルノックインマウスを作成した。STAT3の機能異常はLIFのシグナル伝達を障害して相同組換えをしたES細胞の生存・増殖に悪影響を及ぼす可能性があるため、野生型STAT3のcDNAをネオマイシン耐性遺伝子と共にloxP配列ではさみ、その下流にΔV463のSTAT3-DN変異を配置した。サザンブロッティングでhomologous recombinationしたクローンを選択し、8細胞凝集法でキメラマウスを作製し、高キメリズムのものを選択しC57BL/6マウスと交配、germline transmissionを確認した。このマウスと卵細胞特異的にCreを発現したマウス(ZP3-Creマウス)の雌とを交配し、全身にSTAT3-DNを発現するマウスを作製した。これまでの実験結果で、STAT3-DNを片アレルに発現するマウスでは血清IgEレベルが100倍以上に上昇し、IL-17の産生も低下することが明らかになった。また、ネオマイシン耐性遺伝子はPCR法によっても検出されないため、100%の効率でCreによるloxPサイトの組換えは起こったものと考えられた。さらに、RT-PCR法でこのマウスのSTAT3遺伝子を増幅し、塩基配列を検討したところ正常のアレルが50%、ΔV463のアレルが50%発現していることが確認され、目的としたマウスの作製に成功したことが明らかになった。

原发性免疫缺陷是一种由先天性免疫系统基因异常引起的疾病，为阐明人体免疫系统基因的体内功能做出了巨大贡献。高IgE综合征就是其中一种综合征，表现为金黄色葡萄球菌引起的皮肤和肺部感染、特应性皮炎和血清IgE水平升高。为了阐明高 IgE 综合征中 STAT3 突变的发病机制（我们是世界上第一个发现该综合征致病基因的人），我们创建了表达 STAT3 显性失活突变体的条件敲入小鼠。 STAT3功能异常可能会损害LIF信号转导，并对经过同源重组的ES细胞的存活和增殖产生不利影响。ΔV463的STAT3-DN突变位于下游。通过Southern印迹法选择同源重组克隆，使用8细胞聚集法产生嵌合小鼠，选择嵌合度高的小鼠与C57BL/6小鼠杂交以证实种系传递。该小鼠与在卵细胞中特异性表达 Cre 的雌性小鼠（ZP3-Cre 小鼠）杂交，产生了全身表达 STAT3-DN 的小鼠。先前的实验结果表明，表达单等位基因STAT3-DN的小鼠的血清IgE水平增加了100倍以上，而IL-17的产生减少。此外，由于通过PCR未检测到新霉素抗性基因，因此认为loxP位点的Cre重组以100％的效率发生。此外，当使用RT-PCR扩增该小鼠的STAT3基因并检查碱基序列时，确认50％的正常等位基因和50％的ΔV463等位基因被表达，表明其是成功的。