遺伝子発現再活性化現象を利用したリピータブルタンパク質発現システムの開発

利用基因表达重新激活现象开发可重复的蛋白质表达系统

基本信息

批准号：
21659007
负责人：
高倉喜信
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659007/
关键词：
遺伝子発現肝臓転写因子非ウイルスベクター物理刺激

项目摘要

治療タンパク質を"必要に応じて繰り返し"発現させる「オンデマンド型遺伝子治療システム」の実現を目的に、遺伝子発現再活性化のためのシグナル探索ならびに機構解明を試みた。まず、肝臓で速やかに不活化されるCMVプロモータを含むプラスミドを採用し、肝臓に種々の刺激を加えたときの遺伝子発現変動を解析することで、遺伝子発現を再活性化する刺激の探索を行った。その結果、大容量の等張溶液を血管内に急速に投与するハイドロダイナミクス(HD)法に準じた投与に加えて、肝臓の圧迫、電気パルスなど、肝臓への遺伝子導入方法として有用であることが報告されている方法が、遺伝子発現を再活性化しうることを見出した。以前の検討において、HD法による再活性化には、肝臓でのNF-kappaBやAP-1の活性化が関与することが示されていたことから、これら転写因子を活性化することが知られる肝臓虚血・再灌流(I/R)の遺伝子発現再活性化に及ぼす影響について検討したところ、このI/Rによっても肝臓での遺伝子発現は大きく再活性化することが明らかとなった。そこで、これらの刺激による再活性化メカニズムについて解析を行った。HD法で投与したマウス肝臓は、一時的に容積が2倍以上にもなることから、細胞骨格が変化することが推察された。そこで、形態的な変化について、電子顕微鏡画像で評価したところ、HD法で溶液を投与したマウス肝臓では、肝細胞間の間隙が拡大し、細胞の形状も変化していることが示された。そこで、F-アクチンに特異的に結合するphalloidinを用いて細胞の形態変化に重要なF-アクチンの細胞内分布を評価した結果、HD法で等張溶液を投与したマウスではF-アクチンの一時的な脱重合が観察された。しかしながら、培養細胞を用いた検討では、低張溶液での培養による細胞容積の増大時に遺伝子発現の再活性化現象は一部細胞でしか認められなかった。以上より、HD法による遺伝子導入や再活性化時には細胞が形態学的に変化するものの、この変化は再活性化現象とは直接的には関与しないことが示唆された。

为了实现“按需基因治疗系统”，根据需要表达治疗蛋白“反复表示”，我们试图寻找信号以进行基因表达重新激活并阐明该机制。首先，采用了含有CMV启动子的质粒，该质粒在肝脏中迅速灭活，并在将各种刺激应用于肝脏时分析了基因表达波动，并搜索了重新激活基因表达的刺激。结果，还发现，除了根据流体动力学（HD）方法给药，其中大量的大量溶液被迅速施用到血管中，据报道，同种同性恋的方法可作为基因转移到肝脏中的方法，例如肝压缩和电脉冲，可以重新激活基因表达。先前的研究表明，肝脏中NF-kappab和AP-1的激活参与了HD方法的重新激活，当我们研究肝缺血和再灌注的作用（I/R）时，已知这些转录因子对这些转录因子对基因表达反应的影响，这还表明，I/R还反应基因在liver中的基因表达。因此，我们分析了这些刺激引起的重新激活机理。据估计，随着使用HD方法施用的小鼠肝脏的体积暂时超过体积的两倍，细胞骨架会变化。因此，使用电子显微镜图像评估了形态学变化，并显示在使用HD方法施用溶液的小鼠肝脏中，肝细胞之间的间隙扩大，并且细胞的形状也会改变。因此，我们评估了F-肌动蛋白的细胞内分布，这对于使用鬼笔环肽特异性结合的细胞形态变化很重要，并且在使用HD方法的同位体溶液中施用的小鼠中观察到F-肌动蛋白的临时解聚。然而，在使用培养细胞的研究中，仅在低音溶液中培养的细胞体积增加时，才在某些细胞中观察到基因表达的重新激活现象。从以上提出，尽管使用HD方法在基因转移或重新激活过程中细胞发生形态学变化，但这种变化并不直接有助于重新激活现象。