遺伝子発現再活性化現象を利用したリピータブルタンパク質発現システムの開発

利用基因表达重新激活现象开发可重复的蛋白质表达系统

基本信息

批准号：
21659007
负责人：
高倉喜信
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659007/
关键词：
遺伝子発現肝臓転写因子非ウイルスベクター物理刺激

项目摘要

治療タンパク質を"必要に応じて繰り返し"発現させる「オンデマンド型遺伝子治療システム」の実現を目的に、遺伝子発現再活性化のためのシグナル探索ならびに機構解明を試みた。まず、肝臓で速やかに不活化されるCMVプロモータを含むプラスミドを採用し、肝臓に種々の刺激を加えたときの遺伝子発現変動を解析することで、遺伝子発現を再活性化する刺激の探索を行った。その結果、大容量の等張溶液を血管内に急速に投与するハイドロダイナミクス(HD)法に準じた投与に加えて、肝臓の圧迫、電気パルスなど、肝臓への遺伝子導入方法として有用であることが報告されている方法が、遺伝子発現を再活性化しうることを見出した。以前の検討において、HD法による再活性化には、肝臓でのNF-kappaBやAP-1の活性化が関与することが示されていたことから、これら転写因子を活性化することが知られる肝臓虚血・再灌流(I/R)の遺伝子発現再活性化に及ぼす影響について検討したところ、このI/Rによっても肝臓での遺伝子発現は大きく再活性化することが明らかとなった。そこで、これらの刺激による再活性化メカニズムについて解析を行った。HD法で投与したマウス肝臓は、一時的に容積が2倍以上にもなることから、細胞骨格が変化することが推察された。そこで、形態的な変化について、電子顕微鏡画像で評価したところ、HD法で溶液を投与したマウス肝臓では、肝細胞間の間隙が拡大し、細胞の形状も変化していることが示された。そこで、F-アクチンに特異的に結合するphalloidinを用いて細胞の形態変化に重要なF-アクチンの細胞内分布を評価した結果、HD法で等張溶液を投与したマウスではF-アクチンの一時的な脱重合が観察された。しかしながら、培養細胞を用いた検討では、低張溶液での培養による細胞容積の増大時に遺伝子発現の再活性化現象は一部細胞でしか認められなかった。以上より、HD法による遺伝子導入や再活性化時には細胞が形態学的に変化するものの、この変化は再活性化現象とは直接的には関与しないことが示唆された。

为了实现“按需基因治疗系统”，其中治疗性蛋白质“根据需要”重复表达，我们试图寻找信号并阐明重新激活基因表达的机制。首先，我们使用含有CMV启动子的质粒，该启动子在肝脏中迅速失活，并分析对肝脏施加各种刺激时基因表达的变化，以寻找重新激活Ta基因的刺激。结果发现，除了与血管内快速施用大量等渗溶液的流体动力学(HD)方法类似的施用之外，肝脏压迫、电脉冲等也可用作将基因引入肝脏的方法。报道的方法能够重新激活基因表达。之前的研究表明，HD方法的再激活涉及肝脏中NF-kappaB和AP-1的激活，因此当我们研究肝脏缺血/再灌注（I/R）的影响时，我们知道它会激活这些转录因子。）关于基因表达重新激活，我们发现 I/R 也显着重新激活肝脏中的基因表达。因此，我们分析了这些刺激引起的重新激活机制。通过 HD 方法给药的小鼠肝脏体积暂时增加了一倍以上，表明细胞骨架发生了变化。因此，当使用电子显微镜图像评估形态变化时，显示在使用HD方法用该溶液处理的小鼠肝脏中，肝细胞之间的空间扩大并且细胞的形状发生变化。因此，我们使用与F-肌动蛋白特异性结合的鬼笔环肽来评估F-肌动蛋白的细胞内分布，这对于观察细胞形态变化很重要。然而，在使用培养细胞的研究中，当通过在低渗溶液中培养来增加细胞体积时，仅在某些细胞中观察到基因表达的重新激活。上述结果表明，尽管使用HD方法在基因导入和再激活过程中细胞发生形态变化，但这些变化与再激活现象没有直接关系。