RNA検出用デグラトンプローブの開発とRNA制御機構の解析

用于RNA检测和RNA控制机制分析的降解子探针的开发

基本信息

批准号：
21657043
负责人：
入江賢児
金额：
$ 1.92万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657043/
关键词：
RNA結合タンパク質出芽酵母 Khd1 mRNA デグラトンプローブ Pボディ Stress Granule hnRNP K イメージング

项目摘要

本研究では、『出芽酵母におけるRNA局在と局所的翻訳に働くRNP複合体Locasome』および『動物細胞のストレスに応答したRNAの局在、安定性、翻訳の制御に働くRNP複合体Stress Granule』の系におけるRNA局在・RNA安定性・翻訳の時間的・空間的な制御系を解析し、その基本原理を明らかにする。そのために必要な、(1)生きた細胞内でRNAを高感度に可視化・定量化する『RNA検出用デグラトンプローブ』、(2)2種類のRNAを同時に可視化する『2カラーRNAイメージング』、(3)RNA局在をタンパク質合成と同時に可視化する『RNA-タンパク質デュアルイメージング』、(4)時空間的なタンパク質合成を可視化・定量化する『翻訳モニター系』を開発し、RNAレベルの制御について生きた細胞での高度なイメージング解析、定量化解析を実現させる。明らかにした基本原理をもとに、遺伝子発現をRNAレベルで制御する技術の確立を目指す。本年度の研究では、出芽酵母RNA結合タンパク質KhdlpによるMTL1 mRNA安定性制御に関わるシス領域の限定とMTL1 mRNA安定性制御に関わるトランス因子の同定を行った。その結果、MTL1(532-1032)領域は、khd1変異株においてmRNAを不安定化させるのに必要かつ十分な配列であること、khd1変異株におけるMTL1 mRNAの不安定化には、5'→3'方向のmRNA分解酵素Xrnlpとキャップ構造除去酵素コファクターDcplpが関与することを明らかにした(Mauchi et aL.,2010)。また、Khd1をin vivoでイメージングを行い、Khd1がRNA分解に関わるプロセッシングボディ(Pボディ)に局在することを明らかにした。

This study analyzes the temporal and spatial regulatory systems of RNA localization, RNA stability, and translation in the systems of "Locasome, an RNP complex that works in RNA localization and local translation in budding yeast" and "Stress Granule, an RNP complex that works in the localization, stability, and translation of RNA in response to stress in animal cells," and clarify the basic principles. The necessary for this purpose was developed: (1) the "degraton probe for RNA detection" that visualizes and quantifies RNA within living cells in a highly sensitive way, (2) the "two-color RNA imaging" that visualizes two types of RNA simultaneously, (3) the "RNA-protein dual imaging" that visualizes RNA localization simultaneously with protein synthesis, and (4) the "translation monitor system" that visualizes并量化时空蛋白的合成，以及可视化和量化活细胞中RNA水平控制的“翻译监视器系统”。基于我们阐明的基本原理，我们旨在建立一种调节RNA水平基因表达的技术。在今年的研究中，我们通过发芽的酵母RNA结合蛋白KHDLP限制了参与MTL1 mRNA稳定性调节的顺式区域，并确定了MTL1 mRNA稳定性调节中涉及的反式因子。结果表明，MTL1（532-1032）区域是破坏KHD1突变体中mRNA的必要序列，而KHD1突变体中MTL1 mRNA的不稳定涉及5' - > 3'mRNA DEGRADING酶XRNLP和cap cap cape eNORTER ENER eNROUCHERER eNOUCKE caff（MARA）。 2010）。此外，将KHD1成像在体内成像，以表明KHD1位于与RNA降解有关的加工体（P身体）。