RNA検出用デグラトンプローブの開発とRNA制御機構の解析

用于RNA检测和RNA控制机制分析的降解子探针的开发

基本信息

批准号：
21657043
负责人：
入江賢児
金额：
$ 1.92万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657043/
关键词：
RNA結合タンパク質出芽酵母 Khd1 mRNA デグラトンプローブ Pボディ Stress Granule hnRNP K イメージング

项目摘要

本研究では、『出芽酵母におけるRNA局在と局所的翻訳に働くRNP複合体Locasome』および『動物細胞のストレスに応答したRNAの局在、安定性、翻訳の制御に働くRNP複合体Stress Granule』の系におけるRNA局在・RNA安定性・翻訳の時間的・空間的な制御系を解析し、その基本原理を明らかにする。そのために必要な、(1)生きた細胞内でRNAを高感度に可視化・定量化する『RNA検出用デグラトンプローブ』、(2)2種類のRNAを同時に可視化する『2カラーRNAイメージング』、(3)RNA局在をタンパク質合成と同時に可視化する『RNA-タンパク質デュアルイメージング』、(4)時空間的なタンパク質合成を可視化・定量化する『翻訳モニター系』を開発し、RNAレベルの制御について生きた細胞での高度なイメージング解析、定量化解析を実現させる。明らかにした基本原理をもとに、遺伝子発現をRNAレベルで制御する技術の確立を目指す。本年度の研究では、出芽酵母RNA結合タンパク質KhdlpによるMTL1 mRNA安定性制御に関わるシス領域の限定とMTL1 mRNA安定性制御に関わるトランス因子の同定を行った。その結果、MTL1(532-1032)領域は、khd1変異株においてmRNAを不安定化させるのに必要かつ十分な配列であること、khd1変異株におけるMTL1 mRNAの不安定化には、5'→3'方向のmRNA分解酵素Xrnlpとキャップ構造除去酵素コファクターDcplpが関与することを明らかにした(Mauchi et aL.,2010)。また、Khd1をin vivoでイメージングを行い、Khd1がRNA分解に関わるプロセッシングボディ(Pボディ)に局在することを明らかにした。

在这项研究中，我们将重点关注“Locasome，一种在酿酒酵母中的 RNA 定位和局部翻译中发挥作用的 RNP 复合物”和“Stress Granule，一种在调节 RNA 定位、稳定性中发挥作用的 RNP 复合物”我们将分析该系统中RNA定位、RNA稳定性和翻译的时空控制系统，并阐明其基本原理。为此，我们需要（1）“用于RNA检测的退化探针”，以高灵敏度可视化和定量活细胞中的RNA，（2）“双色RNA成像”，同时可视化两种类型的RNA，（3）RNA定位与蛋白质合成同时进行我们开发了“RNA-蛋白质双重成像”来可视化和（4）“翻译监测系统”来可视化和量化时空蛋白质合成，并且我们开发了活细胞中关于RNA水平控制的先进成像分析和量化。分析。基于我们已经阐明的基本原理，我们的目标是建立在RNA水平上控制基因表达的技术。在今年的研究中，我们通过酿酒酵母RNA结合蛋白Khdlp限制了参与MTL1 mRNA稳定性调节的顺式区域，并鉴定了参与MTL1 mRNA稳定性调节的反式因子。结果，我们发现MTL1(532-1032)区域是khd1突变体中使mRNA不稳定的必要且充分的序列，并且5'→3'方向的mRNA降解酶Xrnlp和帽结构去除酶辅助因子 Dcplp 参与其中（Mauchi 等人，2010）。此外，我们对Khd1进行了体内成像，发现Khd1定位于参与RNA降解的加工体（P体）。