ボツリヌス毒素複合体構成成分の無毒タンパク質を用いた経口的薬物送達システムの開発

使用作为肉毒杆菌毒素复合物成分的无毒蛋白质开发口服药物递送系统

• 批准号: 10J08286
• 负责人: 宮田 恵多
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J08286/
• 关键词: ボツリヌス毒素; 無毒タンパク質; タンパク質間相互作用; 細胞毒性; タンパク質結晶化; 薬物送達システム; 複合体タンパク質; 分子間相互作用

ボツリヌス菌の産生する神経毒素は、A～Gの7種の血清型に分類され、種々の無毒タンパク質成分(NTNHA、HAs)と会合した毒素複合体(TC)として存在している。NTNHAは、神経毒素をプロテアーゼの分解から保護する。このNTNHAを経口的に摂取が困難なペプチド・タンパク質製剤を体内へ経口的に送達させる輸送容器として応用可能ではないかと考えられる。本研究では、D型NTNHAを新規ペプチド・タンパク質製剤輸送容器として応用するために、NTNHAのX線結晶構造解析、NTNHA-神経毒素間相互作用領域解析ならびに細胞毒性試験を行った。NTNHAの結晶化をハンギングドロップ蒸気拡散法で行った結果、0.2×0.1×0.1cmの結晶が析出した。さらに回折実験を行い、最高分解能3.9Å、P321あるいはP3121/P3221に属し、格子定数はa=b=147.85Å、c=229.74Åと測定された。神経毒素とNTNHAの相互作用領域を解析するためにC型、他のD型菌株の産生する神経毒素とNTNHAの再構成試験を行った。全ての神経毒素はD型NTNHAと複合体を形成した。それぞれの解離定数を求めた結果、C型神経毒素が最も強い値を示した。神経毒素のアミノ酸配列を比較したところC型神経毒素のC末端側配列の相同性が高い神経毒素が強い相互作用を示したことから神経毒素とNTNHAの結合は神経毒素のC末端側の関与が考えられた。NTNHAの小腸上皮細胞に対する細胞毒性を培養液中のラクテイトデヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定した。その結果、NTNHAを添加した細胞の培養液中のLDH量は何も添加していない細胞培養液のLDH量と同等の値を示した。このことから、NTNHAは細胞毒性を示さないことが明らかとなった。これらの結果は、新規薬物送達システムを確立する上で重要な知見であると考えられる。

肉毒杆菌产生的神经毒素分为 A 至 G 七种血清型，并以与各种无毒蛋白质成分（NTNHA、HA）相关的毒素复合物（TC）形式存在。 NTNHA 保护神经毒素免遭蛋白酶降解。人们认为，这种NTNHA可以用作运输容器，将难以口服摄取的肽/蛋白质制剂口服输送到体内。在本研究中，为了应用D型NTNHA作为新型肽/蛋白质药物转运容器，我们对NTNHA进行了X射线晶体结构分析、NTNHA与神经毒素相互作用区域的分析以及细胞毒性测试。使用悬滴蒸气扩散法使NTNHA结晶化，结果析出0.2×0.1×0.1cm的晶体。进一步进行衍射实验，最高分辨率为3.9 Å，属于P321或P3121/P3221，确定晶格常数为a=b=147.85 Å，c=229.74 Å。为了分析神经毒素与NTNHA之间的相互作用区域，我们对C型和其他D型菌株产生的神经毒素与NTNHA进行了重构测试。所有神经毒素均与 D 型 NTNHA 形成复合物。确定每种解离常数的结果是，C型神经毒素显示出最强的值。神经毒素的氨基酸序列的比较显示，与C型神经毒素的C端序列具有高度同源性的神经毒素表现出强烈的相互作用，这表明神经毒素的C端侧参与了神经毒素与NTNHA之间的结合。 。通过测量培养基中乳酸脱氢酶（LDH）的量来确定NTNHA对小肠上皮细胞的细胞毒性。其结果是，添加了NTNHA的细胞的培养基中的LDH量与未添加任何物质的细胞培养基中的LDH量相同。这表明NTNHA不表现出细胞毒性。这些结果被认为是建立新的药物输送系统的重要发现。

项目成果

Clostridium botulinum の産生する無毒タンパク質成分を用いたタンパク質製剤送達システムへの応用に向けた基礎的検討

利用肉毒梭菌产生的无毒蛋白质成分应用于蛋白质药物递送系统的基础研究

• 发表时间: 2010
• 作者: Kimiko Hasegawa;Takashi Matsumoto;Akihito Yamano;Keita Miyata;Ken Inui;Koichi Niwa;Toshihiro Watanabe;Tohru Ohyama;宮田恵多;犬井健;宮下慎一郎;堀内亮太;丹羽光一;宮田恵多
• 通讯作者: 宮田恵多

Clostridium botulinumの産生するC型ボツリヌス毒素の小腸上皮細胞透過機構の解析

肉毒梭菌产生的C型肉毒毒素穿透小肠上皮细胞的机制分析

• 发表时间: 2010
• 作者: Kimiko Hasegawa;Takashi Matsumoto;Akihito Yamano;Keita Miyata;Ken Inui;Koichi Niwa;Toshihiro Watanabe;Tohru Ohyama;宮田恵多;犬井健;宮下慎一郎;堀内亮太;丹羽光一;宮田恵多;犬井健
• 通讯作者: 犬井健

D型ボツリヌス毒素複合体の小腸上皮細胞層透過経路に関する研究

D型肉毒毒素复合物渗透小肠上皮细胞层途径的研究

• 发表时间: 2011
• 作者: 吉田悠真;宮下慎一郎;狩野聡史;宮田恵多;犬井健;村松将司;川根武紘;栗原小百合;林慎太郎;渡部俊弘;大山徹;丹羽光一
• 通讯作者: 丹羽光一

Structure determination of toxin complex from Clostridium botulinum serotype D

肉毒梭菌血清型 D 毒素复合物的结构测定

• 发表时间: 2011
• 作者: Kimiko Hasegawa;Takashi Matsumoto;Akihito Yamano;Keita Miyata;Ken Inui;Koichi Niwa;Toshihiro Watanabe;Tohru Ohyama
• 通讯作者: Tohru Ohyama

Characterization of sugar recognition by the toxin complex produced by Clostridium botulinum serotype C variant strain Yoichi

肉毒杆菌血清型 C 变体菌株 Yoichi 产生的毒素复合物的糖识别特性

• DOI: 10.1111/j.1574-695x.2011.00825.x
• 发表时间: 2011
• 期刊: FEMS Immunology Medicul Microbiology
• 作者: Matsuo;T.;Miyata;K.;Inui;K.;Ito;H.;Horiuchi;R.;Suzuki;T.;Yoneyama;T.;Oguma;K.;Niwa;K.;Watanabe;T.;Ohyama;T.
• 通讯作者: T.