超好熱性DNAポリメラーゼによるde novo DNA合成の機構解明とその応用

超嗜热DNA聚合酶DNA从头合成机制的阐明及其应用

基本信息

批准号：
10J07957
负责人：
加藤智博
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの研究から、超好熱性DNAポリメラーゼによるde novo DNA合成の機構の解明に成功し、その抑制策を見出すことができた。しかしあくまで抑制にとどまり、遺伝子検出技術の感度低下を招く恐れが完全に排除できなかった。そこで、DNA増幅過程での不都合を検出過程での高感度化によりカバーするべく、蛍光色素を高輝度化させる新規人工分子インスレーター分子を開発し、蛍光色素導入人工核酸の高輝度化に成功した。さらに本年度は、励起光がバックグラウンドになるという問題を解決するため、FRETの利用を試みることにした。FRETを利用すれば、励起光と検出波長の差が大きくなり、バックグラウンドの問題を解決することができる。しかしこれを実現するためには、DNA二重鎖内における色素間の配向制御を明らかにし、配向の影響を考慮した検出用核酸プローブの設計を行う必要がある。そこで、DNA二重鎖内部に蛍光色素をインターカレートさせて厳密に固定し、距離および配向の制御を厳密に行うことのできるFRET実験系を新たに構築し、これまで非常に困難であった蛍光色素間のFRETの配向依存性を明確かつ詳細に調査することを目指した。その結果、蛍光色素間のFRET効率がDNAの構造由来の配向依存性によって大きく変化し、一定の周期間隔で変化することを見出した。得られた結果をもとに、DNAを剛直な円筒に見立てた簡便な理論モデルを考案し、FRET理論との比較を行った結果、DNA二重鎖内部におけるFRETの配向依存性を理論モデルによって精確に予測可能であることが分かった。この発見は物理化学的にも非常に興味深く、今後のFRETを利用したナノスケール分子のモニタリングツール開発等に大きく貢献できるものである。特に核酸プローブの設計に際しては、配向依存性をしっかりと考慮に入れて設計を行う必要があることも再確認できた。

通过前期研究，我们成功阐明了超嗜热DNA聚合酶从头合成DNA的机制，并找到了抑制它的方法。不过，这只是打压的问题，并不能完全消除基因检测技术灵敏度降低的风险。因此，为了通过提高检测过程中的灵敏度来弥补DNA扩增过程中的不便，我们开发了一种新的人工分子绝缘体分子，可以提高荧光染料的亮度，并成功提高了荧光染料的亮度-引入人工核酸。此外，今年我们决定尝试使用FRET来解决激发光成为背景的问题。利用FRET，激发光和检测波长的差异变大，可以解决背景问题。然而，为了实现这一目标，有必要澄清DNA双链体内染料之间的方向控制，并设计考虑方向影响的检测用核酸探针。因此，我们构建了一个新的 FRET 实验系统，将荧光染料嵌入并紧密固定在 DNA 双链体内部，并允许严格控制距离和方向，这是迄今为止非常困难的目标，我们的目标是清楚、详细地研究方向。荧光染料之间 FRET 的依赖性。结果，我们发现荧光染料之间的 FRET 效率根据 DNA 结构的方向而变化很大，并且以规则的周期间隔变化。基于所获得的结果，我们设计了一个简单的理论模型，将DNA比作刚性圆柱体，并将其与FRET理论进行比较。结果，我们发现DNA双链内部FRET的方向依赖性是通过以下公式确定的：发现理论模型是可以准确预测的。从物理化学角度来看，这一发现非常有趣，并且可以极大地促进未来使用 FRET 监测纳米级分子工具的发展。特别是，在设计核酸探针时，我们能够重申需要考虑方向依赖性。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

蛍光色素の高輝度化を目指した新規人工塩基対の開発

开发新的人工碱基对，旨在提高荧光染料的亮度

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
H.Miyazaki;S.Li;A.Kanda;K.Tsukagoshi;樫田啓・関口康司・浅沼浩之
通讯作者：
樫田啓・関口康司・浅沼浩之

Cyclohexyl "base pairs" stabilize duplexes and intensify pyrene fluorescence by shielding it from natural base pairs

环己基“碱基对”通过屏蔽天然碱基对来稳定双链体并增强芘荧光

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
Org.Biomol.Chem.
影响因子：
0
作者：
H.Kashida;K.Sekiguchi;N.Higashiyama;T.Kato;H.Asanuma
通讯作者：
H.Asanuma

Development of a robust FRET system within DNA duplex using base-surrogate tethering fluorophores(Poster)

使用碱基替代束缚荧光团在 DNA 双链体中开发强大的 FRET 系统（海报）

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kashida;H.; Sekiguchi;K.; Higashiyama;N.; Kato;T.; Asanuma;H.;加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之;加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之
通讯作者：
加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之

Photon-fueled DNA nanodevice carrying two different photoswitches

携带两个不同光电开关的光子驱动 DNA 纳米器件

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
Angew. Chem. Int. Ed.
影响因子：
0
作者：
Nishioka;H.; Liang;X. G.; Kato;T.; Asanuma;H.
通讯作者：
H.

人工塩基対導入による蛍光色素の高輝度化

通过引入人工碱基对提高荧光染料的亮度

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kashida;H.; Sekiguchi;K.; Higashiyama;N.; Kato;T.; Asanuma;H.;加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之;加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之;加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之;加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之;加藤智博・樫田啓・浅沼浩之;加藤智博・樫田啓・浅沼浩之
通讯作者：
加藤智博・樫田啓・浅沼浩之