LDT化学による新しい細胞内蛋白質間相互作用解析技術の開発

利用LDT化学开发新的细胞内蛋白质-蛋白质相互作用分析技术

基本信息

批准号：
10J04905
负责人：
田村朋則
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞機能を理解する上で、細胞内で起こる蛋白質問相互作用を解析するための技術は必要不可欠である。私はそのための新しい手法として、新たに開発した蛋白質化学修飾法であるLDT (Ligand-Directed Tosyl)化学の活用を試みた。LDT化学では、蛋白質に導入したい機能性分子とリガンドをフェニルスルホン酸エステルを介して連結したラベル化剤を用いる。標的蛋白質がラベル化剤を認識すると蛋白質表面のアミノ酸からトシルエステルへのSN2反応が進行し、ラベル化と同時にリガンド部位が切り離される。そのため、蛋白質本来の機能を損なうこと無く、標的選択的かつ部位特異的に機能性分子を蛋白質に導入することが可能である。今年度の研究において私はLDT化学により蛋白質に蛍光色素を導入し、蛋白質問相互作用を蛍光変化により検出できるか検討した。具体的には、蛍光色素としてOregon Green (OG)を有するLDTラベル化剤を合成し、これをFKBP12と反応させた。得られたOG修飾FKBP12溶液に、リガンドであるラバマイシンを添加すると、OG由来の蛍光強度が大きく減少した。その溶液に、FKBP12-ラパマイシン複合体と相互作用する蛋白質FRBを添加すると、蛍光強度は元の値まで回復した。このことからLDT化学を用いてFKBP12に蛍光色素を導入することで、リガンドの結合およびそれに続く蛋白質問相互作用を蛍光強度変化で解析可能な蛍光レポーターを構築可能であることが示された。また、LDT化学によって細胞内在性FKBP12にOGを選択的に導入することで、赤色蛍光蛋白質を融合したFRBとの相互作用をin-cell FRET解析することに成功した。この結果から、LDT化学による内在性蛋白質化学修飾と既存の蛍光蛋白質標識技術を組み合わせることで、内在性蛋白質の機能や動態をイメージング解析可能であることが示された。

分析细胞内发生的蛋白质查询相互作用的技术对于理解细胞功能至关重要。作为实现此目的的新方法，我尝试利用LDT（配体定向甲苯磺酰基）化学，这是一种新开发的蛋白质化学修饰方法。 LDT 化学使用标记剂，通过苯磺酸酯将要引入蛋白质的功能分子与配体连接起来。当靶蛋白识别标记剂时，SN2反应从蛋白质表面的氨基酸进行到甲苯磺酰酯，并且在标记的同时配体位点被切割。因此，可以在不损害蛋白质原有功能的情况下，以靶点选择性和位点特异性的方式将功能分子引入蛋白质中。在今年的研究中，我使用 LDT 化学将荧光染料引入蛋白质中，并研究是否可以通过荧光的变化来检测蛋白质之间的相互作用。具体而言，合成了含有俄勒冈绿(OG)作为荧光染料的LDT标记剂，并与FKBP12反应。当将配体拉万霉素添加到获得的OG修饰的FKBP12溶液中时，源自OG的荧光强度显着降低。当 FRB（一种与 FKBP12-雷帕霉素复合物相互作用的蛋白质）添加到溶液中时，荧光强度恢复到其原始值。这表明，通过使用 LDT 化学将荧光染料引入 FKBP12，可以构建荧光报告基因，该报告基因可以根据荧光强度的变化分析配体结合和随后的蛋白质询问相互作用。此外，通过使用 LDT 化学选择性将 OG 引入内源性 FKBP12，我们成功地对其与融合到红色荧光蛋白的 FRB 的相互作用进行了细胞内 FRET 分析。这些结果表明，通过将 LDT 化学对内源蛋白的化学修饰与现有的荧光蛋白标记技术相结合，可以对内源蛋白的功能和动态进行成像和分析。