早期骨再生を目指した生体分子付与型アパタイト/コラーゲンナノ複合体の合成

用于早期骨再生的生物分子附着磷灰石/胶原纳米复合材料的合成

基本信息

批准号：
10F00209
负责人：
菊池正紀
金额：
$ 0.9万
依托单位：
National Institute for Materials Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

まず、水酸アパタイト/コラーゲン骨類似ナノ複合体(HAp/Col)の合成時にDNAを加え、複合体の形成と同時にDNAを担持する手法の確立を試みた。その結果、HApに対するColとDNAの吸着反応が競争反応となるため、充分なDNA担持を実現することはできなかった。一方、平成22年度に確立した生体分子担持HAp層をHAp/Col上に形成する手法を用い、DNA担持層の形成条件の最適化を行った。Ca/Pモル比を2.0に固定した上で、体液のCa及びPイオン濃度の1倍から4倍のコーティング液を作製した。この溶液にHAp/Col膜を浸漬して、SEMによる表面観察を行ったところ、Ca及びPイオン濃度が2倍以上の溶液で、リン酸カルシウム層が形成されることが確認された。粉末X線回折法により、得られたリン酸カルシウム層はアパタイトと推定された。これら2倍から4倍のCaP層形成溶液にルシフェラーゼプラスミドDNAあるいはDNAに加えて、フィプロネクチン、遺伝子導入補助作用のある脂質を添加し、DNA担持アパタイトコーティング層をHAp/Col膜上にDNA担持アパタイト層を形成した。ポジティブコントロールとして、遺伝子導入が可能であることが確認されているDNA・フィプロネクチン・脂質を含んだリン酸カルシウム層を形成したエチレンビニルアルコール(EVOH)を用いた。これらの基板の上で、CHO-K1細胞を培養し、ルシフェラーゼアッセイにより遺伝子導入効率を測定した。その結果、DNAのみを含んだHAp/Col基板でも、EVOH基板と同等の遺伝子導入効率を示し、HAp/Colがフィプロネクチンや脂質と同程度に遺伝子導入の効果があることが示唆された。さらに、フィプロネクチンと脂質を含んだDNA担持層を形成したHAp/Col上では、EVOHに比べて、コーティング液の濃度が2倍のもので約3倍、濃度が3倍のもので約2倍の遺伝子導入効率を示した。したがって、これら2種類のコーティング液を用いてDNAを担持することで効率的かつ局所的に遺伝子を導入できる材料を合成できることが明らかとなった。

首先，我们尝试建立一种方法，在合成羟基磷灰石/胶原蛋白骨状纳米复合物（HAP/Col）中，添加DNA，并在形成复合物的同时携带DNA。结果，Col和DNA与HAP之间的吸附反应是一种竞争反应，并且不可能足够的DNA支持。另一方面，使用一种形成2010年在HAP/Col上建立的生物分子支持的HAP层的方法优化了DNA支持层的地层条件。在CA/P摩尔比固定为2.0之后，制备了浓度为1至4倍的Ca和P离子的涂层溶液。将HAP/Col膜浸入该溶液中，并通过SEM观察到表面，并确认在Ca和P离子浓度超过两次的溶液中形成了磷酸钙层。通过X射线粉末衍射法估计获得的磷酸钙层是磷灰石。在这2-4次盖层形成溶液中，将菲哌丁香素和脂质带有基因转移辅助剂添加到荧光素酶质粒DNA或DNA中，并在HAP/Col膜上形成DNA支持的磷灰石涂层层。作为一个阳性对照，使用了乙烯乙烯醇（EVOH），该乙烯乙烯醇（EVOH）具有含有DNA，菲哌蛋白和脂质的磷酸钙层，这些层已被证实可以转移基因。在这些底物上培养CHO-K1细胞，并通过荧光素酶测定法测量基因转移效率。结果表明，仅包含DNA的HAP/COL底物显示出与EVOH底物的基因转移效率相似的基因转移效率，这表明HAP/COL具有与菲坦戊克蛋白和脂质相同的作用。此外，在HAP/COL上，具有含有菲朗司蛋白和脂质的DNA支持层，基因转移效率比EVOH高约三倍，与EVOH相比，涂层溶液的浓度高两倍。因此，已经发现，通过使用这两种类型的涂层溶液携带DNA，可以合成可以有效并局部引入基因的材料。