早期骨再生を目指した生体分子付与型アパタイト/コラーゲンナノ複合体の合成

用于早期骨再生的生物分子附着磷灰石/胶原纳米复合材料的合成

基本信息

批准号：
10F00209
负责人：
菊池正紀
金额：
$ 0.9万
依托单位：
National Institute for Materials Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

まず、水酸アパタイト/コラーゲン骨類似ナノ複合体(HAp/Col)の合成時にDNAを加え、複合体の形成と同時にDNAを担持する手法の確立を試みた。その結果、HApに対するColとDNAの吸着反応が競争反応となるため、充分なDNA担持を実現することはできなかった。一方、平成22年度に確立した生体分子担持HAp層をHAp/Col上に形成する手法を用い、DNA担持層の形成条件の最適化を行った。Ca/Pモル比を2.0に固定した上で、体液のCa及びPイオン濃度の1倍から4倍のコーティング液を作製した。この溶液にHAp/Col膜を浸漬して、SEMによる表面観察を行ったところ、Ca及びPイオン濃度が2倍以上の溶液で、リン酸カルシウム層が形成されることが確認された。粉末X線回折法により、得られたリン酸カルシウム層はアパタイトと推定された。これら2倍から4倍のCaP層形成溶液にルシフェラーゼプラスミドDNAあるいはDNAに加えて、フィプロネクチン、遺伝子導入補助作用のある脂質を添加し、DNA担持アパタイトコーティング層をHAp/Col膜上にDNA担持アパタイト層を形成した。ポジティブコントロールとして、遺伝子導入が可能であることが確認されているDNA・フィプロネクチン・脂質を含んだリン酸カルシウム層を形成したエチレンビニルアルコール(EVOH)を用いた。これらの基板の上で、CHO-K1細胞を培養し、ルシフェラーゼアッセイにより遺伝子導入効率を測定した。その結果、DNAのみを含んだHAp/Col基板でも、EVOH基板と同等の遺伝子導入効率を示し、HAp/Colがフィプロネクチンや脂質と同程度に遺伝子導入の効果があることが示唆された。さらに、フィプロネクチンと脂質を含んだDNA担持層を形成したHAp/Col上では、EVOHに比べて、コーティング液の濃度が2倍のもので約3倍、濃度が3倍のもので約2倍の遺伝子導入効率を示した。したがって、これら2種類のコーティング液を用いてDNAを担持することで効率的かつ局所的に遺伝子を導入できる材料を合成できることが明らかとなった。

首先，我们尝试建立一种方法，即当合成氢氧化磷灰石/胶原蛋白骨形纳米复合物（HAP/Col）时，添加了DNA，并且DNA负责形成复合物。结果，Col和DNA与HAP之间的吸附反应是一种竞争反应，因此无法实现足够的DNA。另一方面，我们使用一种形成于2010年在HAP/COL上建立的生物分子的HAP层的方法优化了DNA层的形成。固定CA/P molo的比率为2.0后，产生了体液的Ca和P-离子浓度的1至四倍的涂层溶液。当将HAP/Col膜浸入该溶液中，并通过SEM进行表面观察时，证实用磷酸钙层的溶液形成，其溶液的含量是Ca和p离子浓度的两倍以上。通过粉末状X射线衍射法，获得的磷酸钙层估计为磷灰石。除了荧光素酶DNA或DNA到盖层的溶液，该溶液是两次至四次，加入foplonectin，基因引入辅助脂质，并在HAP/COL上具有DNA的DNA。作为阳性对照，使用了含磷酸钙的DNA，雾素和脂质的乙烯乙烯醇（EVOH），已被证实是遗传引入的。在这些底物上，培养CHO-K1细胞，荧光素酶测定法测量了基因引入效率。结果，建议仅包含DNA的HAP/COL底物显示出与EVOH底物相同的基因引入效率，并且HAP/COL具有将基因引入基因作为菲哌他蛋白或脂质的作用。此外，在HAP/COL上形成了含有雾和脂质的DNA层，涂层溶液的浓度约为3次，浓度约为2倍，大约是浓度的3倍。效率。因此，已经揭示了使用这两种类型的涂层溶液负责DNA来合成可以有效和局部引入基因的材料。