ランタノイド金属イオンの発光を利用した遺伝子発現モニターリングシステムの開発

利用镧系金属离子发光监测基因表达系统的开发

• 批准号: 13780686
• 负责人: 末田 慎二
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyushu Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780686/
• 关键词: 遺伝子発現; ランタノイド金属イオン; リポーターアッセイ; リポーター分子

昨年度の検討に基づいて、リポーター分子となり得るペプチド分子の設計を行った。光増感剤としてはチロシンが有望であることがわかったので、チロシンを配列内に組み込んだモデルペプチドを合成した。その配列としてはひとまず水溶性とランタノイド金属との錯形成能を重視して、EGEGEGTGEGというようなグルタミン酸とグリシンを組み合わせた配列を検討した。このペプチドのランタノイド金属イオン共存下での発光挙動を検討したところ、テルビウムイオン共存下で顕著な発光が確認できた。次に、遺伝子発現のモデルシステムとして、RKI1の発現系を選び、RKI1のC末端に上記のペプチドを繋げたタンパク質を発現させることにした。そのためにまずその発現プラスミドの作成をおこなった。まずRKI1の遺伝子をpET発現ベクターに組み込み、その末端に上記のペプチドをコードするDNA断片を組み込んだ。このプラスミドで大腸菌を形質転換し、発現確認を行ったところ、目的とするタンパクが大量に発現していることがわかった。このタンパクの酵素活性を測定した結果、野生型と同様の活性を保持していることがわかった。また、テルビウムイオンを共存下で発光挙動の確認を行ったところ、テルビウムイオンに特徴的な発光バンドが確認できた。しかしながら、その発光強度はペプチドの場合よりも低下していることがわかった。これは金属イオンがリポーター部位よりもタンパク質の他の部位に結合するためであると考えられた。そこでより金属イオンとの錯形成能が高くしかも発光強度の強いペプチド配列を探すことを目的として、ランダムな配列のDNA断片を作成した。それを発現プラスミドに組み込み大腸菌に形質転換し、多種類のアミノ酸配列をリポーター分子として有するタンパク質を同時に発現させることを試みた。しかし残念ながらリポーター分子として有望な配列を持つタンパクは得られなかった。

根据去年的研究，我们设计了一种可以作为报告分子的肽分子。由于酪氨酸被发现是一种有前途的光敏剂，因此合成了一种在其序列中掺入酪氨酸的模型肽。至于序列，我们关注的是水溶性和与镧系金属形成络合物的能力，并考虑了结合谷氨酸和甘氨酸的序列，例如EGEGEGTGEG。当我们研究该肽在镧系金属离子共存中的发光行为时，证实了在铽离子共存中显着的发光。接下来，我们选择RKI1表达系统作为基因表达的模型系统，并决定表达上述肽与RKI1的C末端连接的蛋白质。为此，我们首先创建了表达质粒。首先，将RKI1基因插入pET表达载体中，并在载体末端插入编码上述肽的DNA片段。当用该质粒转化大肠杆菌并确认表达时，发现目标蛋白大量表达。测量该蛋白质的酶活性的结果发现，其保留了与野生型相同的活性。另外，当确认铽离子共存时的发光行为时，确认了铽离子的发光带特性。然而，发现发光强度低于肽的发光强度。这被认为是因为金属离子结合到蛋白质上的其他位点而不是报告基因位点。因此，我们创建了具有随机序列的DNA片段，目的是寻找与金属离子形成复合物的能力更高、发光强度更强的肽序列。将其整合到表达质粒中，转化到大肠杆菌中，并尝试同时表达具有多种氨基酸序列的蛋白质作为报道分子。然而不幸的是，没有获得具有作为报告分子的有希望的序列的蛋白质。