イオン能動輸送のメカニズム解明へ向けた立体構造解析

三维结构分析阐明活性离子传输机制

• 批准号: 13780523
• 负责人: 小川 治夫
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780523/
• 关键词: P-type ATPase; ion pump; active transport; x-ray crystallography

(1)超高度好熱菌であるMethanococcus jannaschii由来の水溶性P-type ATPaseであるMJ0968の結晶化を試みている。蛋白質の結晶化の為には、サンプルの安定供給が必須である。そのため、精製系の工夫を行った。超高度好熱菌由来の蛋白質は熱に対し耐性があることは良く知られている。また、これら菌由来の蛋白質を大腸菌等で大量発現し精製を行う際、前処理として回収した大腸菌自身を100℃前後で熱し、他の蛋白質を変性させ、精製の簡便化を行う方法は一般的である。そこで、この手法をMJ0968の精製系に組み込んだ。回収した大腸菌は液体窒素で凍らせ、また液体窒素中で粉末に処理した。その結果、回収した大腸菌に熱が均等に行き渡るようになった。C末に6Hisを修飾している関係上、熱処理後はヒスチジンカラムでの1ステップで精製を行えるため、これまで以上に簡便かつ大量に精製サンプルを得る事のできる方法を確立したと言える。現在、この方法で精製を行ったサンプルを用い、結晶化を行っている最中である。(2)シアノバクテリア由来の1)P-type ATPaseの大量発現を試みている。シアノバクテリアPCC6803株を入手し、genomic DNAを単離精製の後、4種類のATPase遺伝子をPCRでサブクローニングした。その後、これら遺伝子を大腸菌用の発現ベクターに組み込み、大腸菌による大量発現を試みたが、大量の発現蛋白質を得るに至っていない。今後、発現系の改良を行い、改善を図る予定である。

(1) 我们正在尝试结晶 MJ0968，这是一种源自超嗜热菌詹氏甲烷球菌的水溶性 P 型 ATP 酶。稳定的样品供应对于蛋白质结晶至关重要。因此，我们设计了净化系统。众所周知，源自超嗜热菌的蛋白质具有耐热性。另外，当使用大肠杆菌大量表达源自这些细菌的蛋白质并纯化时，通常将收集的大肠杆菌本身加热至100°C左右作为预处理，以使其他蛋白质变性并简化纯化。因此，我们将该方法纳入MJ0968纯化系统中。将回收的大肠杆菌在液氮中冷冻并在液氮中加工成粉末。结果，热量均匀地分配给收集到的大肠杆菌。由于C末端被6His修饰，热处理后可以使用组氨酸柱一步纯化，因此可以说我们建立了一种比以往更容易的方法，使我们能够大量获得纯化样品。数量。我们目前正在使用通过这种方法纯化的样品进行结晶。 (2) 我们正在尝试表达大量源自蓝藻的 1) P 型 ATP 酶。我们获得蓝藻菌株PCC6803，分离纯化其基因组DNA，然后通过PCR亚克隆四种类型的ATPase基因。随后，将这些基因插入到大肠杆菌的表达载体中，并尝试使用大肠杆菌进行大规模表达，但未能获得大量表达的蛋白质。未来我们计划完善表达系统，做出改进。