スフィンゴミエリン特異的プローブを用いたラフト制御機構の解析

使用鞘磷脂特异性探针分析筏控制机制

• 批准号: 13771400
• 负责人: 長谷川 顕子
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771400/
• 关键词: スフィンゴミエリン; ラフト; 特異的プローブ; ライセニン; 細胞内輸送; 変異株; 毒素

スフィンゴミエリンは哺乳動物細胞の主要構成脂質で、糖脂質やコレステロールなどとともにマイクロドメインを形成していると考えられている。このマイクロドメインは様々な細胞機能に関与している可能性が示唆されているが、その形成・制御機構はあまり明らかになっていない。本研究では、スフィンゴミエリンと特異的に結合する新規蛋白質ライセニンを用いて、スフィンゴミエリンの細胞内動態や分子間相互作用を解析することにより、マイクロドメインの生理機能を分子レベルで解明することを目指した。昨年度はライセニンとスフィンゴミエリンの結合様式について解析を行い、ライセニンがスフィンゴミエリン依存的に会合体を形成し、膜中に径3nm程度の小孔を開けることを明らかにした。本年度は脂肪酸鎖の異なる様々なスフィンゴミエリンを用いてライセニンとの相互作用を検討したところ、ライセニンはスフィンゴミエリンの親水性頭部のみでなく疎水性側鎖とも相互作用していることが明らかとなった。またスフィンゴミエリン膜の流動性がライセニンの会合体形成に影響することも明らかとなった。これらのことから、単独では可溶性蛋白質であったライセニンがスフィンゴミエリンと結合することにより膜中にもぐり込んでいると考えられる。次にライセニン耐性の培養上皮細胞変異株の性状解析を行った。ライセニン耐性株ではスフィンゴミエリンの合成は正常だが、細胞表面のスフィンゴミエリン量が顕著に低下しており、スフィンゴミエリンの細胞内輸送に異常があると考えられた。蛍光標識脂質を用いた実験の結果、耐性株では新規合成されたスフィンゴミエリンの細胞表面への輸送が低下している可能性が示唆された。リサイクリング経路については検討中である。一方、蛋白質の細胞表面への輸送には異常が認められなかった。

鞘磷脂是哺乳动物细胞的主要脂质成分，被认为与糖脂和胆固醇一起形成微结构域。有人认为该微结构域可能参与多种细胞功能，但其形成和调节机制尚不十分清楚。在本研究中，我们旨在通过使用与鞘磷脂 Ta 特异性结合的新型蛋白溶素来分析鞘磷脂的细胞内动力学和分子间相互作用，从而在分子水平上阐明微结构域的生理功能。去年，我们分析了lysenin和鞘磷脂的结合模式，发现lysenin以鞘磷脂依赖的方式形成聚集体，在膜上打开直径约3 nm的小孔。今年，我们使用具有不同脂肪酸链的各种鞘磷脂研究了与lysenin的相互作用，发现lysenin不仅与鞘磷脂的亲水性头部相互作用，而且还与疏水性侧链Ta相互作用。研究还表明，鞘磷脂膜的流动性影响溶素聚集体的形成。根据这些结果，认为单独为可溶性蛋白质的溶血素通过与鞘磷脂结合而渗透至膜内。接下来，我们分析了培养的抵抗赖氨酸的上皮细胞突变体的特征。在溶菌素抗性菌株中，鞘磷脂合成正常，但细胞表面的鞘磷脂量明显减少，表明细胞内鞘磷脂的转运存在异常。使用荧光标记脂质的实验表明，在抗性菌株中，新合成的鞘磷脂向细胞表面的转运可能会减少。回收路线正在考虑中。另一方面，蛋白质向细胞表面的转运没有观察到异常。