電離放射線によるDNA障害修復過程における複製制御酵素Cdc7の動態解析

复制控制酶Cdc7在电离辐射引起的DNA损伤修复过程中的动态分析

基本信息

批准号：
13771115
负责人：
角忠輝
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771115/
关键词：
Cdc7 Dbf4 細胞周期放射線障害 UV 細胞分化

项目摘要

今年度は、電離放射線および紫外線によるDNA障害の際に認められる、内在性のヒトCdc7並びにその調節因子であるDbf4の動態解析を行った。使用した細胞株は(1)ヒト白血病細胞株(U937,HL60)、(2)ヒト正常肺線維芽細胞株(IMR-90)、(3)ヒト毛細血管拡張性運動失調症皮膚細胞株(AT3BI, GMO2052A)である。結果は以下の通りである。1.Cdc7の基質であるMCM2タンパクに対する抗体を用いてウェスタンブロッティング法によりその発現量を観察したところ、分化誘導時にはどの細胞株でも遅くとも24時間以内に発現量は減少した。2.細胞周期の制御に関与するpRBタンパクとヒトCdc7の直接的な働きを調べるために、免疫沈降法を用いてウェスタンブロッティングを行ったが、両者に直接的な結合は見られなかった。3.DNA障害や分化誘導時に見られるCdc7の発現量の変化が、Cdc7タンパクのUbiquitinationとどのような関係を有しているかについて、プロテアソームインヒビターであるLactacystinを用いてその機序を調べた。プロテアソームの機能が阻害されているにもかかわらず、Cdc7の発現量に変動が見られたことから、Cdc7の発現制御がタンパク合成以前に行われている可能性が示唆された。4.RDS (Radioresistant DNA Synthesis)の状態を観察するため、上記1.(2)並びに(3)の細胞株に電離放射線照射を行い、ウェスタンブロッティング法により細胞内のCdc7の分布を観察した。Cdc7タンパクの発現は正常細胞では2時間の後に減少するが、AT3BI, GMO2052Aの両細胞株では発現に変動は無かった。

今年，我们分析了在电离辐射和紫外线引起的 DNA 损伤过程中观察到的内源性人类 Cdc7 及其调节因子 Dbf4 的动态。使用的细胞系是（1）人白血病细胞系（U937，HL60），（2）人正常肺成纤维细胞系（IMR-90），和（3）人共济失调毛细血管扩张皮肤细胞系（AT3BI），GMO2052A）。。结果如下。 1.当我们使用抗体通过Western印迹观察作为Cdc7的底物的MCM2蛋白的表达水平时，我们发现在诱导分化后的所有细胞系中最迟24小时内表达水平下降。 2.为了研究参与细胞周期控制的pRB蛋白和人Cdc7的直接作用，我们使用免疫沉淀进行了Western blotting，但没有观察到两者之间的直接结合。 3.我们使用蛋白酶体抑制剂Lactacystin来研究DNA损伤和分化诱导过程中观察到的Cdc7表达水平的变化与Cdc7蛋白泛素化之间的关系。尽管蛋白酶体功能受到抑制，但观察到Cdc7表达水平的变化，表明Cdc7的表达可能在蛋白质合成之前受到调节。 4.为了观察RDS（Radiopressive DNA Synthesis）的状态，对上述1.（2）和（3）中描述的细胞系进行电离辐射照射，并通过Western blotting观察Cdc7在细胞内的分布。尽管在正常细胞中2小时后Cdc7蛋白表达下降，但在AT3BI和GMO2052A细胞系中表达没有变化。