化学発光・蛍光イメージング技法を用いた昆虫体内時計リズム形成プロセスの解明

利用化学发光和荧光成像技术阐明昆虫生物钟节律形成过程

基本信息

批准号：
09J10825
负责人：
森岡絵里
金额：
$ 1.34万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度においては、第一に、本研究の予備実験として行ってきた、キイロショウジョウバエ前胸線細胞の時計遺伝子/タンパク質発現および細胞内Ca^<2+>スパイク頻度リズムにおけるシナプス性調節についての研究成果を、Nature Communications誌に投稿し、4名の査読者からのコメントを受け、これに対し追加実験を行った。現在、リバイズ原稿を再投稿し、プレアクセプトされたところである。第二に、前年度までのイメージング実験により得られた研究成果から明らかとなった、キイロショウジョウバエ中枢時計ニューロン(LNs)における概日性細胞内pHリズムが、個体レベルの概日性出力と関連性を持つのかどうかを検証した。具体的には、まず細胞内プロトン濃度調節に関与すると推定される4つの候補遺伝子(V-ATPase、mitochondrial K^+(Ca^<2+>)/H^+ exchanger、Na^<+->driven anion exchangerおよびNa^+/H^+ exchanger)に対するRNAi系統(Vha100-RNAi、LETM1-RNAi、Ndae1-RNAiおよびNHE1-RNAi)をVienna Drosophila RNAi Centerから入手した。これらの系統と中枢時計ニューロンドライバー系統との交配により、LNs特異的に目的遺伝子をノックダウンした系統を作出し、その個体の歩行活動リズムを測定した。その結果、LNs特異的にmitochondrial K^+/H^+ exchangerをノックダウンした系統(Pdf-gal4;LETM1-RNAi)において、有意に自由継続周期が長周期化することが明らかとなった(LETM1-RNAi=23.54±0.09時間、Pdf-gal4;LETM1-RNAi=24.36±0.08時間、P<.01,one way ANOVA)。現在、この歩行活動性に変化が見られた系統のLNの細胞内pHホメオスタシスにどのような変化が生じているかを検証するために、RNAiと同時に蛍光pHセンサーdeGFP4を発現する系統を作出し、イメージング技法を用いた一過的細胞内酸性化による細胞内pH変動の測定に取り組んでいる。

去年，我们首先关注了果蝇前胸细胞时钟基因/蛋白表达和细胞内Ca^2+尖峰频率节律的突触调节研究成果，作为本研究的初步实验，我们将其提交给了该研究。《自然通讯》杂志收到了四位审稿人的评论，并根据这些评论进行了额外的实验。修改稿现已重新提交并已被预先接受。其次，通过截至前一年进行的成像实验获得的研究结果表明，果蝇中央时钟神经元（LN）的昼夜节律细胞内pH节律与个体水平的昼夜节律输出相关，我验证了它是否存在。具体来说，我们首先鉴定了四个可能参与细胞内质子浓度调节的候选基因（V-ATPase、线粒体 K^+(Ca^<2+>)/H^+ 交换器、Na^<+-> RNAi 系 (Vha100 -RNAi、LETM1-RNAi、Ndae1-RNAi 和 NHE1-RNAi）针对维也纳果蝇从 RNAi 中心获得。通过将这些线与中央时钟神经元驱动线交叉，我们创建了一条线，其中目标基因在 LN 中被特异性敲除，并测量了个体的运动活动节律。结果发现，在LN中特异性敲除线粒体K^+/H^+交换子的品系中（Pdf-gal4；LETM1-RNAi），自由运行时间明显变长（LETM1 -RNAi=23.54±0.09小时，Pdf-gal4；LETM1-RNAi=24.36±0.08小时，P<.01，单向方差分析）。目前，为了验证观察到运动活性变化的菌株中 LN 的细胞内 pH 稳态发生了什么样的变化，我们创建了一种与 RNAi 同时表达荧光 pH 传感器 deGFP4 的菌株。使用成像技术测量由瞬时细胞内酸化引起的细胞内 pH 波动。