原子間力顕微鏡を用いた1分子力学計測によるタンパク質自由エネルギー地形の研究

使用原子力显微镜进行单分子动力学测量的蛋白质自由能形貌研究

基本信息

批准号：
09J08842
负责人：
谷口幸範
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

原子間力顕微鏡(AFM)を用いてタンパク質1分子に外力を加え、メカニカルな力によりタンパク質をアンフォールディングさせることが近年可能になった。本研究はこの手法を駆使し、タンパク質の機械的安定性やその機能との相関を自由エネルギー地形に基づき定量的に理解することを目的とした。タンパク質1分子伸長実験では目的タンパク質を基板-カンチレバー間に強固に結合させる必要がある。従来、固定化には金表面とタンパク質末端部に人工的に導入したシステイン残基とのAu-S結合を利用する方法等が広く用いられてきたが、この方法は内在性システインを含むタンパク質には適さない。そこで、HaloTagを利用したタンパク質の新規固定化方法を考案し、研究期間内に開発に成功した。この新手法により内在性システインを持つタンパク質についても1分子伸長実験を効率的に行えるようになった。これとは別に、腫瘍抑制因子として知られるp53をモデルとして、DNA結合ドメイン(DBD)とリガンドであるDNA、およびN末端領域との相互作用を、AFMによる1分子伸長実験により調べる研究を立ち上げた。フォースカーブに現れるp53DBDのアンフォールディングパターンをプローブとしてDNAの結合を検出できることを発見した(投稿中)。これらにより、タンパク質1分子伸長実験の対象を広げることに成功し、また断片的ではあるが機能に関連する情報を得ることが出来た。本手法、本分野および周辺分野の一層の発展が期待できる成果である。

近年来，通过使用原子力显微镜（AFM）对单个蛋白质分子施加外力，利用机械力来展开蛋白质已成为可能。本研究的目的是利用该方法基于自由能形貌定量了解蛋白质机械稳定性与其功能之间的相关性。在单蛋白分子延伸实验中，需要将目标蛋白牢固地结合在基底和悬臂之间。传统上，利用金表面和人工引入蛋白质末端的半胱氨酸残基之间的Au-S键进行固定的方法并不适用。因此，我们利用 HaloTag 设计了一种新的蛋白质固定方法，并在研究期间成功开发出来。这种新方法可以对具有内源半胱氨酸的蛋白质进行有效的单分子延伸实验。另外，我们以已知的肿瘤抑制因子 p53 作为模型，开展了一项研究，通过使用 AFM 的单分子延伸实验来研究 DNA 结合域 (DBD)、配体 DNA 和 N 末端区域之间的相互作用塔。我们发现，可以使用 p53DBD 的展开模式来检测 DNA 结合，该模式出现在力曲线中作为探针（目前正在提交）。通过这些努力，我们成功地扩大了单分子蛋白质延伸实验的范围，并且能够获得功能相关的信息，尽管是碎片化的。这些结果预计将导致该方法、该领域以及相关领域的进一步发展。