有機化学的手法と分子生物学的手法を融合させた機能性プローブの開発

结合有机化学和分子生物学方法开发功能探针

基本信息

批准号：
09J00556
负责人：
渡辺修司
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞が生きたまま、生体分子の挙動や局在を可視化する技術はタンパク質の生体内での機能を詳細に明らかにするために極めて有用な手法である。これまでに我々はタンパク質を蛍光性小分子で標識する技術として、β-ラクタマーゼ変異体を用い、β-ラクタム化合物を特異的にラベル化する手法を確立している。これまでに小分子を用いたタンパク質ラベル化法は数多く報告されているが、その殆どは未反応プローブがバックグラウンドとなってしまうために、細胞洗浄が必要であった。そのため細胞小器官などの洗浄の困難な部位への応用や標的タンパク質のリアルタイム解析には限界があった。そこでβ-ラクタムのプロドラッグを用いることで優れた細胞膜透過性を有するラベルプローブを開発した。その高い細胞内集積性を利用することで細胞洗浄操作を行う事無く、細胞内タンパク質の特異的ラベル化に成功している。また新規発蛍光性ラベル化プローブとしてアゾピリジンを脱離基として有するプローブを合成した。新規ラベル化プローブはBL-tagとのラベル化に伴う優れた蛍光応答性を示し、未反応プローブを取り除く事無く標的タンパク質を特異的かつ迅速に可視化することに成功した。そして、分子内塩を形成させることで膜透過性を有しており、未反応プローブ存在下における細胞内タンパク質の特異的ラベル化にも成功している。本研究においてタンパク質蛍光イメージングの基礎技術が確立され、Gタンパク質共役受容体などの創薬に重要なタンパク質の挙動解析を可能にするものと期待される。

在细胞还活着的同时，可视化生物分子和定位的行为的技术对于详细阐明蛋白质的功能非常有用。迄今为止，我们已经建立了一种专门使用β-内酰胺酶化合物的方法，该方法使用β-内酰胺酶变体作为一种指示具有荧光装饰的蛋白质的技术。迄今为止，已经报道了许多使用小分子的蛋白质标记方法，但是其中大多数需要细胞清洁，因为虚幻探针成为背景。因此，适用于清洁难度（例如细胞）以及对靶蛋白的实际时间分析有限制。因此，我们通过使用β-内酰胺Pro药物开发了具有出色细胞膜通透性的标签探针。在没有细胞清洁操作的情况下，已经成功使用了其高细胞积分，并具有特定的细胞内蛋白标记。另外，已合成了偶氮丁氨酸具有细分的探针，作为新的荧光标记探针。新的标签探针显示出对使用BL-TAG的标签的出色荧光响应，并在不删除未反应的探针的情况下专门并迅速地可视化了靶蛋白。然后，通过形成内部分子盐，它具有膜的渗透性，并且在存在未反应探针的存在中也成功地标记了细胞内蛋白的特定标记。可以预期，在这项研究中已经建立了蛋白质荧光成像的基本技术，并且预计将对G蛋白CO -OR受体等药物发现进行蛋白质行为分析。