iPS細胞作製を目的とした細胞内動態解析に基く効率的非ウイルス型遺伝子導入法開発

开发基于 iPS 细胞生产的细胞内动力学分析的高效非病毒基因转移方法

基本信息

批准号：
09F09131
负责人：
橋田充
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

iPS細胞作製において、安全な繊維芽細胞への遺伝子導入法が重要である。効率的な遺伝子発現に向けた多機能性遺伝子デリバリーキャリアにおいては、プラスミドDNA複合体の粒子径縮小化、細胞取り込み、エンドソームからの脱出ならびに低細胞毒性が具備すべき機能である。リジンの分岐構造を有するリジンデンドリマーやリジンデンドリマーのリジン末端をアルギニンで修飾したアミノ酸デンドリマーがエンドソーム脱出能を有する効率的な遺伝子導入キャリアであることが報告されてきた。本研究では、昨年度までに開発した、アルギニン修飾リジンデンドリマーに膜透過能と核移行能を有するTATペプチドを結合させた遺伝子導入能に優れたTAT-PEGアミノ酸デンドリマー/プラスミドDNA/アミノ酸デンドリマー三元複合体を用いたマウス繊維芽細胞NIH3T3細胞への遺伝子導入機構の細胞内動態の解析を行った。rhodamine修飾pDNAを用い、細胞のエンドソーム膜をFITCで染色することで、細胞内局在の検証を行った結果、TAT-PEGアミノ酸デンドリマー三元複合体は、一部エンドソームに存在したが、細胞質内への移行が認められ、一部は核あるいは核膜への分布が認められた。一方、対照のアミノ酸デンドリマー三元複合体では、大部分がエンドソームに分布が認められた。また、プロトンポンプ阻害剤であるbafiromycin存在下、TAT-PEGアミノ酸デンドリマー三元複合体の遺伝子発現は有意に低下し、エンドソーム内においてpH応答的にpDNAを細胞質内へ移行させていることが示唆された。一方、遺伝子導入実験に用いた条件において細胞毒性を評価したところ、TAT-PEGアミノ酸デンドリマー三元複合体の細胞毒性はほとんど認められなかった。これらの知見は、安全な繊維芽細胞への非ウイルス性遺伝子導入キャリア開発において、有益な基礎的知見となることが期待される。

将基因安全导入成纤维细胞的方法对于 iPS 细胞的生产非常重要。用于高效基因表达的多功能基因递送载体必须具有以下功能：质粒DNA复合物的粒径减小、细胞摄取、从核内体逃逸以及低细胞毒性。据报道，具有支链赖氨酸结构的赖氨酸树枝状聚合物和其中赖氨酸树枝状聚合物的赖氨酸末端被精氨酸修饰的氨基酸树枝状聚合物是具有从核内体逃逸能力的有效基因转移载体。在本研究中，我们将介绍一种具有优异基因转移能力的TAT-PEG氨基酸树枝状大分子/质粒DNA/氨基酸树枝状大分子三元复合物，它是去年开发的精氨酸修饰的赖氨酸树枝状大分子，具有膜渗透性的TAT肽和我们利用人体分析了小鼠成纤维细胞 NIH3T3 的基因转移机制的细胞内动力学。使用罗丹明修饰的pDNA，通过FITC对细胞内体膜进行染色来验证细胞内定位，结果发现TAT-PEG氨基酸树枝状三元复合物部分存在于内体中，但不存在于细胞质中。分布于细胞核或核膜内。另一方面，在对照氨基酸树枝状聚合物三元复合物中，主要分布于核内体中。此外，在质子泵抑制剂巴弗洛霉素存在下，TAT-PEG氨基酸树枝状大分子三元复合物的基因表达显着降低，表明pDNA以pH响应方式易位到核内体的细胞质中。另一方面，当在基因转移实验中使用的条件下评估细胞毒性时，对于TAT-PEG氨基酸树枝状聚合物三元复合物几乎没有观察到细胞毒性。这些发现有望为开发将非病毒基因转移到成纤维细胞的安全载体提供有用的基础知识。