局所神経回路の定量的解析に向けたウイルスベクターの開発

开发用于局部神经回路定量分析的病毒载体

• 批准号: 21650083
• 负责人: 金子 武嗣
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21650083/
• 关键词: レンチウイルス; 遺伝子改変動物; Cre/loxP; Tet-Onシステム; Tet-Offシステム; 中枢神経系; 局所神経回路; 定量的解析; Cre; loxP

本研究課題では、Creを細胞種特異的に発現する遺伝子改変動物とレンチウイルスベクターを組み合わせることで、ある特定の神経細胞群にのみ目的遺伝子を発現させ、単一神経細胞の入出力特性を定量的に記述することを目的とする。昨年度は(a)2種の遺伝子(X&Y)を共発現するレンチウイルスベクターの開発を行った。Tet応答性・双方向性プロモーター(TREB)、脳心筋炎ウイルス由来のIRES、手足口病ウイルス由来のF2A配列の比較検討を行ったところ、X/Yの発現量の比・両者の総発現量において、F2Aが優れていることが明らかとなった。本年度は(b)Cre存在下のみで目的遺伝子を発現するレンチウイルスベクター、(c)Cre発現遺伝子改変動物の開発を進めた。(b) ウイルスベクターに搭載できる遺伝子の長さには制限があるため、『FLEX switch(Schnutgen et al., 2003)』を介した遺伝子発現の開発を進めた。293細胞を用いたin vitro実験では、レンチウイルスに搭載した『FLEX switch』が効率的に働くことが分かった。この『FLEX switch』を搭載した各種レンチウイルスベクターの開発、及びアデノ随伴ウイルスベクター・アデノウイルスベクターの開発も進めた。皮質錐体細胞特異的にCreを発現する遺伝子改変動物を用いて予備実験を行ったところ、in vivoにおいても『FLEX switch』が効率的に働き、細胞種特異的遺伝子発現に有用であることが明らかになった。(c) BAC DNAを用いた遺伝子改変動物の作出、及びMMRRCからの購入も進めた。現在までに数ラインにおいて、Creの特異的発現を確認している。今後は、本研究課題で開発したウイルスベクター・遺伝子改変動物を利用し、神経回路網の定量的解析を進めていきたいと考えている。

在这个研究项目中，通过将以细胞类型特异性方式表达Cre的转基因动物与慢病毒载体相结合，我们将仅在特定的神经元组中表达目标基因，并量化单个神经元的输入输出特征目的是描述神经元。去年，我们开发了（a）一种共表达两种类型基因（X&Y）的慢病毒载体。对Tet响应双向启动子（TREB）、脑心肌炎病毒来源的IRES和手足口病病毒来源的F2A序列进行比较研究，揭示了X/Y表达量的比率以及两者的总表达量。很明显F2A更胜一筹。今年，我们继续开发 (b) 仅在 Cre 存在的情况下表达靶基因的慢病毒载体，以及 (c) 表达 Cre 的转基因动物。 (b) 由于可以加载到病毒载体中的基因长度有限，我们继续通过“FLEX switch”开发基因表达（Schnutgen et al., 2003）。使用 293 细胞进行的体外实验表明，安装在慢病毒上的“FLEX 开关”可以有效地工作。我们还开发了配备此 FLEX 开关的各种慢病毒载体，以及腺相关病毒载体和腺病毒载体。使用在皮质锥体细胞中特异性表达 Cre 的转基因动物进行的初步实验表明，“FLEX 开关”在体内有效发挥作用，并且可用于细胞类型特异性基因表达。 (c) 继续使用 BAC DNA 创造转基因动物并从 MMRRC 购买。迄今为止，Cre 的特异性表达已在多个品系中得到证实。未来，我们希望利用本研究项目中开发的病毒载体和转基因动物对神经网络进行定量分析。

项目成果

ラット視床内側腹側核ニューロンの軸索投射を単一ニューロンレベルで解析する

单神经元水平分析大鼠内侧丘脑腹核神经元的轴突投射

• 发表时间: 2010
• 作者: 倉本恵梨子;藤山文乃;古田貴寛;雲財知;日置寛之;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣

TET-OFFレンチウィルスベクターによるマーモセット脳への遺伝子導入

使用 TET-OFF 慢病毒载体将基因导入狨猴大脑

• 发表时间: 2010
• 作者: 渡我部昭哉;高司雅史;仲神友貴;日置寛之;金子武嗣;加藤成樹;小林和人;川島尚之;奥野浩行;尾藤晴彦;北村義浩;山森哲雄
• 通讯作者: 山森哲雄

VGLUT3発現・非セロトニン作動性神経細胞は投射型ニューロンであり、ラット背側縫線核において亜核を構成する

表达 VGLUT3 的非血清素能神经元是投射神经元，构成大鼠中缝背核中的亚核。

• 发表时间: 2010
• 作者: 日置寛之;中村悠;馬雲飛;今野美知輝;早川隆;中村公一;藤山文乃;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣

BAC遺伝子改変マウスを用いた、パルブアルブミン発現皮質神経細胞への抑制性入力の分類

使用 BAC 基因修饰小鼠对表达小清蛋白的皮质神经元的抑制输入进行分类

• 发表时间: 2011
• 作者: 日置寛之;亀田浩司;今野美知輝;岡本慎一郎;鳥生直哉;藤山文乃;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣

RFP発現レンチウイルスによる中枢神経細胞の可視化

使用表达 RFP 的慢病毒观察中枢神经细胞

• 发表时间: 2009
• 作者: 岡本慎一郎;日置寛之;今野美知輝;亀田浩司;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣