局所神経回路の定量的解析に向けたウイルスベクターの開発

开发用于局部神经回路定量分析的病毒载体

• 批准号: 21650083
• 负责人: 金子 武嗣
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21650083/
• 关键词: レンチウイルス; 遺伝子改変動物; Cre/loxP; Tet-Onシステム; Tet-Offシステム; 中枢神経系; 局所神経回路; 定量的解析; Cre; loxP

本研究課題では、Creを細胞種特異的に発現する遺伝子改変動物とレンチウイルスベクターを組み合わせることで、ある特定の神経細胞群にのみ目的遺伝子を発現させ、単一神経細胞の入出力特性を定量的に記述することを目的とする。昨年度は(a)2種の遺伝子(X&Y)を共発現するレンチウイルスベクターの開発を行った。Tet応答性・双方向性プロモーター(TREB)、脳心筋炎ウイルス由来のIRES、手足口病ウイルス由来のF2A配列の比較検討を行ったところ、X/Yの発現量の比・両者の総発現量において、F2Aが優れていることが明らかとなった。本年度は(b)Cre存在下のみで目的遺伝子を発現するレンチウイルスベクター、(c)Cre発現遺伝子改変動物の開発を進めた。(b) ウイルスベクターに搭載できる遺伝子の長さには制限があるため、『FLEX switch(Schnutgen et al., 2003)』を介した遺伝子発現の開発を進めた。293細胞を用いたin vitro実験では、レンチウイルスに搭載した『FLEX switch』が効率的に働くことが分かった。この『FLEX switch』を搭載した各種レンチウイルスベクターの開発、及びアデノ随伴ウイルスベクター・アデノウイルスベクターの開発も進めた。皮質錐体細胞特異的にCreを発現する遺伝子改変動物を用いて予備実験を行ったところ、in vivoにおいても『FLEX switch』が効率的に働き、細胞種特異的遺伝子発現に有用であることが明らかになった。(c) BAC DNAを用いた遺伝子改変動物の作出、及びMMRRCからの購入も進めた。現在までに数ラインにおいて、Creの特異的発現を確認している。今後は、本研究課題で開発したウイルスベクター・遺伝子改変動物を利用し、神経回路網の定量的解析を進めていきたいと考えている。

该研究主题是结合遗传修饰的物质，这些物质与慢病毒载体特别表达CRE仅在特定神经元中表达靶基因，并定量地描述单个神经元的输入/输出特征。去年，我们开发了共表达两个基因（X＆Y）的慢病毒载体。我们比较并检查了TET反应性和双向启动子（TREB），脑膜炎病毒的IRES以及手，脚和口腔疾病病毒的F2A序列，并揭示F2A在X/y表达水平和两者的总表达水平的比率上表现出色。今年，我们一直在开发仅在CRE存在下表达靶基因的慢病毒载体，以及（c）CRE表达的基因。 （b）由于可以安装在病毒载体上的基因长度的局限性，因此我们通过Flex开关开始了基因表达的发展（Schnutgen等，2003）。在使用293个细胞的体外实验中，发现安装在慢病毒上的Flex开关有效地工作。我们还开发了配备了这种“屈曲开关”的各种慢病毒载体，并开发了与腺相关的病毒载体和腺病毒载体。使用特异性在皮质锥体细胞中表达CRE的转基因物质进行了初步实验，并揭示了“ Flex Switch”在体内有效起作用，并且对细胞类型特异性基因表达有用。 （c）还生产了使用BAC DNA的遗传改性产物，还从MMRRC购买。迄今为止，CRE的特定表达已在几行中得到证实。将来，我们希望使用本研究主题中开发的病毒载体和转基因材料对神经网络进行定量分析。

项目成果

ラット視床内側腹側核ニューロンの軸索投射を単一ニューロンレベルで解析する

单神经元水平分析大鼠内侧丘脑腹核神经元的轴突投射

• 发表时间: 2010
• 作者: 倉本恵梨子;藤山文乃;古田貴寛;雲財知;日置寛之;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣

TET-OFFレンチウィルスベクターによるマーモセット脳への遺伝子導入

使用 TET-OFF 慢病毒载体将基因导入狨猴大脑

• 发表时间: 2010
• 作者: 渡我部昭哉;高司雅史;仲神友貴;日置寛之;金子武嗣;加藤成樹;小林和人;川島尚之;奥野浩行;尾藤晴彦;北村義浩;山森哲雄
• 通讯作者: 山森哲雄

VGLUT3発現・非セロトニン作動性神経細胞は投射型ニューロンであり、ラット背側縫線核において亜核を構成する

表达 VGLUT3 的非血清素能神经元是投射神经元，构成大鼠中缝背核中的亚核。

• 发表时间: 2010
• 作者: 日置寛之;中村悠;馬雲飛;今野美知輝;早川隆;中村公一;藤山文乃;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣

BAC遺伝子改変マウスを用いた、パルブアルブミン発現皮質神経細胞への抑制性入力の分類

使用 BAC 基因修饰小鼠对表达小清蛋白的皮质神经元的抑制输入进行分类

• 发表时间: 2011
• 作者: 日置寛之;亀田浩司;今野美知輝;岡本慎一郎;鳥生直哉;藤山文乃;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣

RFP発現レンチウイルスによる中枢神経細胞の可視化

使用表达 RFP 的慢病毒观察中枢神经细胞

• 发表时间: 2009
• 作者: 岡本慎一郎;日置寛之;今野美知輝;亀田浩司;金子武嗣
• 通讯作者: 金子武嗣