シナプス前クロライド濃度勾配の発生機構の解明

阐明突触前氯离子浓度梯度的产生机制

基本信息

批准号：
21650093
负责人：
神谷温之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21650093/
关键词：
海馬シナプス伝達 GABA クロライドイオン

项目摘要

海馬苔状線維シナプスのシナプス前都にはGABA_A受容体が発現することが近年の研究で明らかになった。クロライドチャンネルであるGABA_A受容体の活性化により苔状線維終末の脱分極を生じることから、シナプス前部では細胞内クロライド濃度が細胞体より高く保たれていると推定されている。今年度は、細胞内クロライド濃度の神経細胞内の空間的な分布や濃度勾配を直接的に証明するために、蛍光クロライド指示薬を用いたシナプス前部でのクロライドイメージングを試みた。マウス海馬スライス標本において苔状線維の起始細胞である歯状回顆粒細胞に単一細胞レベルで蛍光クロライド指示薬MEQを負荷するために、単一細胞エレクトロボレーションの条件検討を行い、小型の細胞である歯状回顆粒細胞の細胞体に直視下に蛍光色素を効率的に導入することが可能になった。しかしながら、顆粒細胞の軸索である苔状線維軸索は極めて微細で、また、スライス内を立体的に走行し、共焦点顕微鏡を用いても苔状線維の神経終末部まで連続して蛍光をモニターすることが困難な場合がしばしばであった。そこで、もうひとつのアプローチとして、細胞膜透過型蛍光クロライド指示薬であるdihydro-MEQ(6-methoxy-N-ethyl-1,2-dihydroquinoline)を軸索標識法により多くの苔状線維に同時に導入することを試みている。苔状線維軸索の走行するCA3野透明層にdihydro-MEQを微量注入し、軸索内に取り込まれた後に軸索輸送の機構を介して輸送されることを利用して、多くのスライス表面の苔状線維シナプス前部(終末部および軸索部)に蛍光クロライド指示薬を負荷するための条件検討を行った。

最近的研究表明，GABA_A 受体在海马苔藓纤维突触的突触前部位表达。由于 GABA_A 受体（氯离子通道）的激活导致苔藓纤维末端去极化，因此推测突触前区域的细胞内氯离子浓度保持高于细胞体。今年，为了直接展示神经元内细胞内氯离子浓度的空间分布和浓度梯度，我们尝试使用荧光氯离子指示剂在突触前区域进行氯离子成像。为了在小鼠海马切片制备物的单细胞水平上加载齿状回颗粒细胞（苔藓纤维的起源细胞）和荧光氯化物指示剂MEQ，我们检查了单细胞电硼化的条件，现在已经成为可能在直视下将荧光染料有效引入齿状回颗粒细胞的细胞体内。然而，苔藓纤维轴突（颗粒细胞的轴突）非常微小，并且在切片内呈三维运行，即使使用共聚焦显微镜，也可以连续检测到苔藓纤维神经末梢的荧光。通常很难监控。因此，另一种方法是尝试使用轴突标记方法将二氢-MEQ（6-甲氧基-N-乙基-1,2-二氢喹啉）（一种细胞膜可渗透的荧光氯化物指示剂）同时引入到许多苔藓纤维中。通过将少量二氢MEQ注射到苔藓纤维轴突行进的CA3区域的透明层中，并利用其被吸收到轴突中并通过轴突运输机制运输的事实，可以应用我们研究了将荧光氯化物指示剂加载到苔藓纤维突触前区域（末端和轴突）的条件。