異物排出システム群の連携作動の解析と多剤耐性緑膿菌感染症克服への応用

异物排泄系统协同运作分析及其在克服多重耐药铜绿假单胞菌感染中的应用

基本信息

批准号：
13226122
负责人：
後藤直正
金额：
--
依托单位：
Kyoto Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226122/
关键词：
Pseudomonas aeruginosa 排出ポンプ異物排出遺伝子発現 Mex RND 外膜タンパク質基質認識

项目摘要

本研究は緑膿菌のマルチコンポーネント型異物排出システム作動の分子機構および発現機構を明らかにすることにより、排出システム阻害薬の創製のみならず、抗菌薬によらない新規化学療法の展開を目指すものである。ゲノム配列から翻訳したアミノ酸配列のin silico解析を基にオリゴペプチドを合成し、ウサギポリクロナル抗体を作成した。それらの特異性は排出システム・ホモログ発現プラスミドから発現したタンパク質と抗体との反応性から確認した。こうして、5種のRNDコンポーネント・ホモログおよび3種の外膜コンポーネント・ホモログ特異抗体を作成した。これらの抗体でLブロスなどの培地で増殖した実験室株PA01での発現を調べたところ、5種類のホモログの発現は検出限界以下であった。一方、既知排出システムのうち、MexXY/OprMおよびMexCD-OprJはLブロスなどでは発現していないが、抗菌薬も含めた異物の添加によって適応的に発現することが分かった。一方、排出システム・ホモログのノックアウトは抗菌薬感受性や蛍光基質に対する排出活性に影響を与えなかった。しかし、排出システム・ホモログのコンポーネント遺伝子の発現プラスミドを用いて、既知の排出システムとのキメラシステムを構築したところ、明らかな排出活性が観察された。こうしてホモログの排出機能が明らかになった。さらに臨床分離緑膿菌のゲノムDNAを鋳型にして、mexD遺伝子をPCR増幅によりクローン化し、プラスミド・ライブラリーを構築した。それらをMexC-OprJ発現株への導入により基質特異性変異体を検索し、基質域拡張型のMexD変異体を得た。この変異体遺伝子の塩基配列の解析および部位特異的変異導入実験からRNDコンポーネントによる基質認識は、ペリプラスムループで起こっていることが示唆された。

通过阐明铜绿假单胞菌多组分异物外排系统运作的分子机制和表达机制，本研究的目的不仅是创造外排系统抑制剂，而且还旨在开发不依赖抗生素的新型化疗药物。基于对从基因组序列翻译的氨基酸序列进行计算机分析，合成了寡肽，并创建了兔多克隆抗体。它们的特异性通过抗体与外排系统同系物表达质粒表达的蛋白质的反应性得到证实。以此方式，创建了五种RND成分同源物和三种外膜成分同源物特异性抗体。当我们研究在 L 肉汤等培养基中生长的实验室菌株 PA01 中这些抗体的表达时，五种同源物的表达低于检测限。另一方面，在已知的外排系统中，MexXY/OprM和MexCD-OprJ在L肉汤等中不表达，但发现通过添加包括抗生素在内的外来物质适应性地表达。另一方面，外排系统同系物的敲除并不影响抗菌敏感性或对荧光底物的外排活性。然而，当我们使用外排系统同系物的组成基因的表达质粒构建具有已知外排系统的嵌合系统时，观察到明显的外排活性。这样就阐明了同系物的排泄功能。进一步以临床分离的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆mexD基因，构建质粒文库。我们通过将底物特异性突变体引入 MexC-OprJ 表达菌株来寻找底物特异性突变体，并获得了具有扩展底物范围的 MexD 突变体。该突变基因的碱基序列分析和定点诱变实验表明，RND 成分的底物识别发生在周质环中。