C型肝炎ウイルスワクチン開発のためのCD81の構造生物学的研究

CD81用于丙型肝炎病毒疫苗开发的结构生物学研究

• 批准号: 13226056
• 负责人: 北所 健悟
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226056/
• 关键词: C型肝炎ウイルス; 膜4階貫通型タンパク質Tetrasapnin; CD81タンパク質; X線構造解析; ウイルスレセプター; ワクチン開発; タンパク質結晶化; HCV結合部位

C型肝炎ウイルスレセプターであるCD81タンパク質のメジャー細胞外ドメインであるLELタンパク質(CD81-LEL)とペプチド性の阻害剤を共結晶させた外形並びに結晶学的データが全く異なる新規な結晶についてSPring-8において2.6Å分解能のデータ測定を行い、この回折強度データと既に構造解析を整えたNativeの立体構造を基に、分子置換法の手法を用いて立体構造を決定した。その結果、阻害剤部分の電子密度については観測することはできなかったが、新たな結晶系においては、その立体講造が大きく変化していることが判った。その部位は、とりわけHCVが結合すると考えられるheadサブドメインであり、HCVの結合に重要であるPhe186残基の周辺が大きく変化していることが判った。その結果、2つの結晶系におけるCD81-LELの立体構造決定により、4つの可能なコンフォーメーションを得ることができた。2量体の形成に関与するStalkサブドメインは、立体構造が保持されていることから生体内においてもCD81が2量体として存在することを示唆している。一方、HCVの結合に関与するHeadサブドメインは、立体構造の柔軟さが観測された。HCV-E2蛋白質の結合に必須であるPhe186残基並びにその周辺の疎水性アミノ酸からなる疎水性クラスターは溶媒側に突出して存在し、いずれの構造においても、結晶内で他の対称な分子とパッキングしていた。従って、この領域がHCVとの相互作用に関与する部位であると考察できる。また、CD81-LELタンパク質の発現精製を行い、もう一つのCD81の細胞外ドメインであるSELタンパク質(Small Extracellular Loop)との複合体の共結晶化実験を試みた。SELタンパク質はLELと共存することにより、HCV結合の活性を促進することがわかっている。このことより、CD81のLEL/SELの全細胞外ドメインの立体構造決定は、HCVワクチン開発を考える上で重要であると考えられる。共結晶化スクリーニングの結果、新たな結晶形を有するLEL/SEL複合体タンパク質結晶を得る事ができた。Spring-8にてX線回折データ測定を行ったところ、2.0A分解能のデータを収集することができ、空間群がC2に属する新規な結晶系に属することがわかった。

关于一种具有完全不同的外部形状和晶体学数据的新晶体，该晶体是LEL蛋白（CD81-LEL）的共结晶，该蛋白是丙型肝炎病毒受体CD81蛋白的主要胞外结构域和肽抑制剂SPring-8数据以2.6 Å分辨率测量，根据该衍射强度数据和已经进行结构分析的Native 3D结构，使用分子置换法确定3D结构。结果，虽然无法观察到抑制剂部分的电子密度，但发现新晶系的三维结构发生了显着变化。该位点是头亚结构域，HCV被认为是在此处结合的，结果发现对HCV结合很重要的Phe186残基周围的区域发生了显着变化。结果，通过确定CD81-LEL在两个晶系中的三维结构，获得了四种可能的构象。参与二聚体形成的 Stalk 子结构域保留了其三维结构，表明 CD81 在体内以二聚体形式存在。另一方面，观察到参与 HCV 结合的 Head 子结构域具有构象灵活性。 Phe186 残基（对于 HCV-E2 蛋白结合至关重要）和由其周围的疏水性氨基酸组成的疏水性簇向溶剂侧突出，并且在任一结构中，它们都在我正在做的晶体内填充有其他对称分子。它。因此，可以认为该区域参与与HCV的相互作用。我们还表达并纯化了CD81-LEL蛋白，并尝试了其与SEL蛋白（小细胞外环）（CD81的另一个细胞外结构域）的复合物的共结晶实验。已知SEL蛋白通过与LEL共存来促进HCV结合活性。由此看来，在考虑HCV疫苗开发时，确定CD81 LEL/SEL整个胞外域的三维结构被认为是重要的。通过共结晶筛选，我们获得了具有新晶型的LEL/SEL复合蛋白晶体。我们在Spring-8进行X射线衍射数据测量时，能够采集到分辨率为2.0A的数据，发现该晶系属于空间群属于C2的新晶系。

项目成果

北所健悟: "C型肝炎ウイルスに結合する4回膜貫通型レセプターCD81の細胞外ドメインの結晶構造"構造生物. 7. 27-39 (2001)

Kengo Kitasho：“与丙型肝炎病毒结合的四跨膜受体 CD81 的胞外结构域的晶体结构”《结构生物学》7. 27-39 (2001)。

北所健悟 他: "4回膜貫通型C型肝炎ウイルスレセプターCD81の構造と機能"日本生物物理学会第39回年会講演予稿集. 41. S43-S43 (2001)

Kengo Kitasho 等：“四跨膜丙型肝炎病毒受体 CD81 的结构和功能”日本生物物理学会第 39 届年会论文集 41. S43-S43 (2001)。

北所健悟 他: "C型肝炎ウイルスレセプターCD81の構造と機能"日本結晶学会平成13年度年会講演要旨集. 72-72 (2001)

Kengo Kitasho 等人：“丙型肝炎病毒受体 CD81 的结构和功能”日本晶体学会 2001 年年会论文集 72-72 (2001)。

北所健悟: "C型肝炎ウイルスレセプターCD81の細胞外ドメインの立体構造"生物物理学会誌. 240. (2002)

Kengo Kitasho：“丙型肝炎病毒受体 CD81 胞外结构域的三级结构”，《生物物理学会杂志》240。（2002 年）

Kitadokoro K. 他: "SUBUNIT ASSOCIATION AND CONFORMATIONAL FLEXIBILITY IN THE HEAD-SUBDOMANIN OF HUMAN CD81 LARGE EXTRACELLULAR LOOP"Biol.Chem.. (2002)

Kitadokoro K. 等人：“人类 CD81 大细胞外环的头亚结构域中的亚单位关联和构象灵活性”Biol.Chem.. (2002)