葉緑体形質転換系を用いたNAD(P)H脱水素酵素の逆遺伝学的解析

利用叶绿体转化系统对 NAD(P)H 脱氢酶进行反向遗传分析

基本信息

批准号：
01J03826
负责人：
高林厚史
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

アマランサスを材料としたNDHの精製を続けて行い、Ni^<2+>を用いた金属アフィニティクロマトグラフィーにより、NDHは構造・活性を保ったまま効率の良く精製できることを明らかとした。さらに、そのクロマトグラフィー後にBlue-Native PAGEを行い、NBTをアクセプターとした活性染色を組み合わせることで500-600kDa付近にNDHの活性バンドを検出することに成功したが、現段階ではN末端解析などによる同定には至っていない。今後は精製材料としているアマランサスの初期量をさらに増やすと共に、新たに作成中の抗体を用いたアフィニティ精製なども試すなどし、NDHの未知サブユニットの同定にこぎつけたい。また、PAMクロロフィル蛍光解析によるNDH活性の高い植物のスクリーニングの結果、C4光合成のNAD-Malic Enzyme型のサブタイプに属する植物の活性が高いことを見出した。これは、C4光合成のサブタイプによって、葉肉細胞と維管束鞘細胞の循環的電子伝達経路の要求性および光化学系IIの量が異なるためであると考えられた。そこでNADP-ME型およびNAD-ME型の植物からそれぞれ葉肉細胞と維管束鞘細胞を単離し、NDHとPSIIの量比を見積もった結果、期待通りの結果が得られている。今後、顕微鏡PAMを用い、葉肉細胞と維管束鞘細胞を分けてクロロフィル蛍光を用いたNDHの活性を測定することで、先の仮説をさらに検証する。

我们继续使用苋菜作为材料纯化NDH，发现通过使用Ni ^ 2+ 的金属亲和层析可以有效地纯化NDH，同时保留其结构和活性。此外，通过层析后进行Blue-Native PAGE并结合NBT作为受体的活性染色，我们成功地检测到500-600 kDa左右的NDH活性条带，但尚未达到鉴定。未来，我们希望进一步增加苋菜作为纯化材料的初始用量，并尝试使用新创建的抗体进行亲和纯化，以鉴定NDH的未知亚基。此外，通过使用PAM叶绿素荧光分析筛选NDH活性高的植物，我们发现属于C4光合作用的NAD-苹果酸酶型亚型的植物具有高活性。这被认为是因为，根据C4光合亚型的不同，叶肉细胞和维管束鞘细胞之间的循环电子传递途径和光系统II的量的要求也不同。因此，我们分别从NADP-ME和NAD-ME植物中分离叶肉细胞和维管束鞘细胞，并估计NDH与PSII的比率，结果与预期一致。未来，我们将通过使用PAM显微镜分离叶肉细胞和维管束鞘细胞并利用叶绿素荧光测量NDH活性来进一步验证上述假设。