外有毛細胞に存在するモーター蛋白質プレスチンの変形量解析:一分子直接計測の試み

外毛细胞运动蛋白prestin变形量分析：直接单分子测量的尝试

• 批准号: 20659263
• 负责人: 和田 仁
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659263/
• 关键词: 聴覚; 内耳; 外有毛細胞; 膜タンパク質; プレスチン; 原子間力顕微鏡; 単分子力顕微鏡法; 一分子計測; Prestin

蝸牛内コルチ器に存在する外有毛細胞(Outer hair cell : OHC)は膜電位に同期した伸縮運動を示す.その伸縮運動により我々の聴覚の鋭敏さが実現されている.OHCの伸縮運動の源は,細胞側壁に存在するタンパク質モータプレスチン(prestin)の構造変化であると考えられている.プレスチンが膜電位を感知し,変形して2種類の形状,すなわち「小さい状態」と「大きい状態」を取り,その大きさの違いでOHCの細胞長を変化させていると推察されている.しかし現状ではプレスチンのような膜タンパク質の立体構造を計測する方法は確立されておらず,そのためプレスチンの構造変化メカニズムは解明されていない.本研究では,原子間力顕微鏡を用いてプレスチンの構造を一分子レベルで直接計測し,膜貫通構造の解明を目指す.モータ分子プレスチンの構造が明らかになれば,OHCの伸縮運動のメカニズムの解明が大きく前進すると考えている.その成果は,聴覚の鋭敏性すなわちOHCの伸縮による蝸牛増幅機構の全容解明へ発展すると期待できる.平成21年度は原子間力顕微鏡でプレスチン一分子の分子間力を計測することを目指し,下記の研究を行った.[1]Aviタグ融合プレスチンを発現させたChinese hamster ovary細胞(哺乳類由来細胞株)の細胞膜を単離しビオチン化する手法を確立した.[2]ストレプトアビジンで修飾した原子間力顕微鏡のカンチレバーを用いて,ビオチン化したプレスチンを一分子引張試験するために必要な実験条件の最適化を行った.[3]プレスチン一分子の分子間力計測を行い,プレスチンの膜貫通構造を解析した.

耳蜗柯蒂氏器中存在外毛细胞OHC）表现出与膜电位同步的弹性运动。这种弹性运动与我们听力的敏锐度有关。OHC弹性运动的来源是细胞侧壁中存在的蛋白质运动蛋白prestin。 Prestin 感知膜电位并改变膜电位。据推测，OHC细胞有“小”和“大”两种形状，并且OHC的长度根据大小而变化，目前还没有确定的方法来测量蛋白质的三维结构。因此 prestin 的结构变化尚未确定。其机制尚未阐明。本研究将利用原子力显微镜在单分子水平上直接测量prestin的结构，旨在阐明其跨膜结构。如果明确了运动分子prestin的结构，OHC我们相信，这将极大地推进对伸缩运动机制的阐明。该结果预计将彻底阐明由于 OHC 的扩张和收缩而导致的耳蜗放大机制，这有助于听力的敏锐度。 2009 财年，我们的目标是测量 prestin 单分子的分子间力使用原子力显微镜，将进行以下研究[1]中文表达Avi标记的prestin。我们建立了一种分离和生物素化仓鼠卵巢细胞（哺乳动物来源的细胞系）细胞膜的方法。 [2] 使用链霉亲和素修饰的原子力显微镜悬臂进行生物素化 prestin 的单分子拉伸测试。 [3] 我们测量了 prestin 单分子的分子间力并分析了 prestin 的跨膜结构。

项目成果

Site-directed mutagenesis of the motor protein prestin

运动蛋白 prestin 的定点诱变

• 发表时间: 2010
• 作者: 内田 浩;荒瀬 透;小野政徳;各務真紀;小田英之;西川明花;丸山哲夫;吉村泰典;和田仁
• 通讯作者: 和田仁

Atomic force microscopic imaging of the inner ear motor protein prestin using quantum dots

使用量子点对内耳运动蛋白 prestin 进行原子力显微成像

• 发表时间: 2009
• 作者: 浅田弘法;古谷正敬;西尾 浩;升田博隆;内田 浩;丸山哲夫;梶谷 宇;木挽貢慈;吉村泰典;鈴木翔;丸山哲夫;熊野峻;村越道生
• 通讯作者: 村越道生

モルモット蝸牛における外有毛細胞の運動能により生じる力の数値解析

豚鼠耳蜗外毛细胞运动能力产生的力的数值分析

• 发表时间: 2008
• 作者: 佐藤心平;他
• 通讯作者: 他

High resolution imaging by atomic force microscopy of prestin purified and reconstituted into an artificial lipid bilayer

通过原子力显微镜对 prestin 进行高分辨率成像，纯化并重构为人工脂质双层

• 发表时间: 2010
• 作者: 浅田弘法;古谷正敬;西尾 浩;升田博隆;内田 浩;丸山哲夫;梶谷 宇;木挽貢慈;吉村泰典;鈴木翔;丸山哲夫;熊野峻
• 通讯作者: 熊野峻

原子間力顕微鏡とQdotを用いた内耳モータータンパク質プレスチンの可視化

使用原子力显微镜和 Qdot 观察内耳运动蛋白 prestin

• 发表时间: 2009
• 作者: 浅田弘法;古谷正敬;西尾 浩;升田博隆;内田 浩;丸山哲夫;梶谷 宇;木挽貢慈;吉村泰典;鈴木翔;丸山哲夫;熊野峻;村越道生;丸山哲夫;Tetsuo Maruyama;村越道生
• 通讯作者: 村越道生