非線形分子分光技術を用いた細胞イメージングシステムの開発

利用非线性分子光谱技术开发细胞成像系统

• 批准号: 20655013
• 负责人: 中林 孝和
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20655013/
• 关键词: 非線形分光; フェムト秒レーザー; 和周波発生; FAD; 細胞内環境; イメージング; 生体分析; 細胞; 高調波発生; 白色光; 蛍光タンパク質

フェムト秒レーザーを用いた非線形分光法と顕微鏡による細胞観測技術とを組合せた細胞イメージングシステムを開発することを目的とする。平成21年度は、昨年度製作したシステムを用いて和周波発生法によるイメージング測定について検討した。現有のフェムト秒チタンサフアィアレーザーからの出力光を2つに分け、片方はフォトニック結晶ファイバーに導入し、白色光パルスを発生させる。もう片方のビームは和周波光を発生させるためのゲート光とする。F値がより高い分光器に検出系を変更したが、十分な和周波光強度は得られてはいない。パルス幅を先鋭化させることによって非線形信号が増加することから、フェムト秒パルスを分散補償させることによって、和周波光の強度を増加させることを行っている。非線形分光法を用いることによって、生体内にはじめから存在するクロモフォアであるNADHやFADなどの補因子の検出を行い、無染色の細胞イメージング測定が可能となる。これらの補因子の電子状態と細胞内環境との対応関係を調べるために、FADおよびNADHの吸収・蛍光スペクトルおよびナノ秒からフェムト秒に渡る光励起ダイナミクスの媒質依存性について検討した。FADはアデニン基とイソアロキサジン基の2つの芳香族環を持ち、2つの芳香族環が離れたOpen formと2つの芳香族環が近接したStacked formの2つのコンフォマーを持つ。水溶液中でStacked formが支配的であるが、媒質の誘電率が低下するにつれて、Stacked formの分布数が減少し、Open formの分布数が増加することがわかった。またフェムト秒時間分解蛍光分光法から、Stacked formの2つの芳香族環の距離が誘電率の減少に伴い増加することがわかった。これらの結果は、Open formとStacked formの分布数比およびStacked formの分子構造を調べることによって、細胞内の誘電的環境が求められることを示唆する。このような構造変化について非線形分光法からも検討を行い、細胞内の誘電的環境を調べる有力な手法となるのか検討を行う予定である。

该项目的目的是开发一种细胞成像系统，该系统结合了使用飞秒激光的非线性光谱和使用显微镜的细胞观察技术。 2009 年，我们利用去年创建的系统，利用和频生成方法研究了成像测量。现有飞秒钛蓝宝石激光器的输出光被分成两束，一半被引入光子晶体光纤以产生白光脉冲。另一束光束用作产生和频光的门光。虽然检测系统更换为F值更高的光谱仪，但没有获得足够的和频光强。由于非线性信号通过锐化脉冲宽度而增加，因此通过色散补偿飞秒脉冲来增加和频光的强度。通过使用非线性光谱，可以检测 NADH 和 FAD 等辅因子（它们是生物体中天然存在的发色团），并进行免染色细胞成像测量。为了研究这些辅因子的电子态与细胞内环境之间的对应关系，我们研究了FAD和NADH的吸收光谱和荧光光谱以及从纳秒到飞秒的光激发动力学的介质依赖性。 FAD具有两个芳香环，即腺嘌呤基团和异咯嗪基团，并且具有两种构象异构体：两个芳香环分开的开放形式和两个芳香环彼此靠近的堆叠形式。在水溶液中，堆叠形式占主导地位，但随着介质介电常数的降低，堆叠形式的数量减少，开放形式的数量增加。此外，飞秒时间分辨荧光光谱表明，堆叠形式的两个芳环之间的距离随着介电常数的降低而增加。这些结果表明，可以通过检查开放和堆叠形式的分布数量比以及堆叠形式的分子结构来确定细胞内介电环境。我们计划使用非线性光谱研究这种结构变化，看看这是否是研究细胞内介电环境的有效方法。

项目成果

ポリマー中における色素分子発光スペクトルへの電場効果と光励起ダイナミクス

电场效应和光激发动力学对聚合物中染料分子发射光谱的影响

• 发表时间: 2008
• 作者: T. Nakabayashi;N. Ohta;大原渡,福政修;T. Nakabayashi;大原渡;Takakazu Nakabayashi;中野貴裕,田内康,大原渡,福政修;Takakazu Nakabayashi;穐本和樹;中林孝和
• 通讯作者: 中林孝和

Application of fluorescence lifetime imaging to the investigation of cellular microenvironments

荧光寿命成像在细胞微环境研究中的应用

• 发表时间: 2008
• 作者: T. Nakabayashi;N. Ohta;大原渡,福政修;T. Nakabayashi
• 通讯作者: T. Nakabayashi

Effects of Semitransparent Metal Substrates on Confocal Reflection Interference Contrast Images of Non-Fluorescent Bio-Systems and Polymers

半透明金属基底对非荧光生物系统和聚合物共焦反射干涉对比度图像的影响

• 发表时间: 2008
• 作者: T. Nakabayashi;N. Ohta
• 通讯作者: N. Ohta

細胞内自家蛍光成分の光励起ダイナミクスの解明(2):FADのフェムト秒-ナノ秒領域の蛍光ダイナミクスのアルコール濃度依存性

阐明细胞内自发荧光成分的光激发动力学（2）：FAD飞秒-纳秒区域荧光动力学的酒精浓度依赖性

• 发表时间: 2010
• 作者: M. ElSabbagh;K. Sasaki;M. Kaneko;Y Ikeda;中林孝和
• 通讯作者: 中林孝和

Studies on Microenvironment in a Single Cell using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

利用荧光寿命成像显微镜研究单细胞微环境

• 发表时间: 2009
• 作者: 中林孝和;太田信廣;大原渡;T. Nakabayashi
• 通讯作者: T. Nakabayashi