タグ融合タンパクを利用した系1複合体の分子集合装置の精製と解析

使用标签融合蛋白纯化和分析系统1复合物的分子组装装置

基本信息

批准号：
12025223
负责人：
高橋裕一郎
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

光化学系1複合体の合成に必須で、葉緑体遺伝子にコードされるYcf4タンパクは、複合体を形成し光化学系1複合体のアセンブリー装置として機能すると考えられている。本研究では、タグを融合したYcf4タンパクが形成する複合体の精製をアフィニティクロマトグラフィーを利用して行い、アセンブリー装置の解析を進めた。まず、緑藻クラミドモナスの葉緑体形質転換系を用いて、Ycf4タンパクのC末端もしくはN末端に6残基のヒスチジンから成るHis-tagを融合した形質転換体を作出した。得られた形質転換体のHis-tag融合Ycf4タンパクの蓄積量は、野生株のYcf4タンパク蓄積量に比べて著しく減少していた。さらに、可溶化したHis-tag-Ycf4タンパク複合体の精製をNi-resinクロマトグラフィーを用いて行ったが、タグ融合Ycf4タンパクがカラムに吸着されず不成功であった。そこで、プロテインAのIgG結合領域とカルモジュリン結合領域をそれぞれ含むTAPタグをYcf4タンパクのC末端に融合した形質転換体を作出した。今度は、Ycf4タンパクの蓄積量は野生株のそれとほぼ同じで、光化学系1複合体の合成活性も保存されていた。IgG beadsとカルモジュリンカラムの2段階の精製も可能であることが示された。しかし、アフィニティークロマトグラフィー後のタンパクの回収効率がかなり低く、精製条件の最適化などを検討する必要がある。今後、従来の生化学的手法とタグを利用したアフィニティクロマトグラフィーの手法を組みあわせて、Ycf4複合体の精製法を確立していきたい。

Ycf4 蛋白对于光系统 1 复合体的合成至关重要，由叶绿体基因编码，被认为形成该复合体并充当光系统 1 复合体的组装装置。在本研究中，我们使用亲和层析纯化标签融合的Ycf4蛋白形成的复合物，并对组装装置进行分析。首先，利用绿藻衣藻的叶绿体转化系统，制作了在Ycf4蛋白的C末端或N末端融合有由6个组氨酸残基构成的His标签的转化体。与野生株中积累的Ycf4蛋白的量相比，获得的转化体中积累的His标签融合Ycf4蛋白的量显着减少。此外，使用Ni-树脂层析纯化可溶化的His-标签-Ycf4蛋白复合物，但标签融合的Ycf4蛋白没有吸附到柱上并且不成功。因此，制作了包含蛋白A的IgG结合区和钙调蛋白结合区的TAP标签与Ycf4蛋白的C末端融合的转化体。这次，Ycf4蛋白积累量与野生型菌株几乎相同，并且光系统1复合体的合成活性也得以保留。结果表明，使用 IgG 珠和钙调蛋白柱进行两步纯化也是可能的。但亲和层析后蛋白质回收效率相当低，需要考虑纯化条件的优化。未来，我们希望通过结合传统的生化方法和使用标签的亲和层析来建立一种纯化Ycf4复合物的方法。