ゼブラフィシュ卵黄細胞の中胚葉誘導活性に関与する遺伝子の単離と機能解析

斑马鱼卵黄细胞中胚层诱导活性相关基因的分离和功能分析

• 批准号: 00J04209
• 负责人: 坂口 拓哉
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The Graduate University for Advanced Studies
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J04209/
• 关键词: ゼブラフィシュ; 卵黄多核層; 中胚葉誘導; 内胚葉; 226D7; in situ hybridization screening

脊椎動物の初期発生において、中胚葉および内胚葉の形成はその後の形態形成の基礎となる重要な過程である。これまでに、小型脊椎動物モデルであるゼブラフィシュにおいては、最も初期の中胚葉と内胚葉は、卵黄細胞からのシグナルによって誘導されることを明らかになっている。しかし、その分子的機構については不明な点が多く、特に中胚葉誘導や内胚葉形成に関与する機構については分かっていない。そこで本研究では、卵黄細胞特異的に発現する遺伝子を多数単離し、得られた遺伝子の機能解析をする事を通して、卵黄細胞の持つ誘導能の分子的機構を明らかにすることにした。そのためにまず、卵黄細胞特異的遺伝子を濃縮したサブトラクションライブラリを作成し、そのライブラリから約600クローンを独自に開発したin situ hybridization screening法でスクリーニングした。その結果、30以上の独立な卵黄細胞で発現するクローンを単離する事に成功した。さらに、それらのクローンをモルフォリノオリゴで特異的に機能阻害することにより、上記の現象に関与するクローンを探した。その結果、モルフォリノオリゴで機能を阻害すると内胚葉を全て欠失する、226D7クローンを見出した。226D7クローンの遺伝子全長は新規のSOX型転写因子をコードしており、発生の初期、胞胚期から原腸期胚期にかけて、卵黄細胞と内胚葉前駆細胞で発現していた。さらにそれらの発現は内胚葉形成に重要な働きをすることがすでに知られていたNodalシグナルの下流で制御されていることが分かった。また、モルフォリノオリゴによる機能阻害実験と合成RNAによる機能亢進実験の結果、226D7は初期内胚葉の形成に必要十分な機能を持っていることを明らかにした。

在脊椎动物的早期发育过程中，中胚层和内胚层的形成是后续形态发生的重要过程。迄今为止，研究表明，在小型脊椎动物模型斑马鱼中，最早的中胚层和内胚层是由卵黄细胞的信号诱导形成的。然而，其分子机制仍有许多未知之处，特别是中胚层诱导和内胚层形成的机制。因此，在本研究中，我们分离了大量在卵黄细胞中特异性表达的基因，并通过对获得的基因进行功能分析，决定阐明卵黄细胞诱导能力的分子机制。为此，我们首先创建了富含卵黄细胞特异性基因的消减文库，并利用我们自主开发的原位杂交筛选方法从该文库中筛选出约600个克隆。结果，我们成功分离了在 30 多个独立卵黄细胞中表达的克隆。此外，我们通过用吗啉寡核苷酸特异性抑制这些克隆的功能来寻找与上述现象有关的克隆。结果，我们发现了一个226D7克隆，当它的功能被吗啉寡核苷酸抑制时，它的内胚层完全缺失。 226D7克隆的全长基因编码一种新型SOX型转录因子，该因子在囊胚期到原肠胚期的早期发育过程中在卵黄细胞和内胚层祖细胞中表达。此外，它们的表达被发现受到 Nodal 信号下游的调节，而 Nodal 信号在内胚层形成中发挥着重要作用。另外，使用吗啉寡核苷酸的功能抑制实验和使用合成RNA的功能增强实验的结果表明，226D7具有早期内胚层形成所必需且充分的功能。

项目成果

Sakaguchi T., Mizuno T., Takeda H.: ""Formation and patterning roles of the yolk syncytial layer." In Pattern Formation in Zebrafish"Springer-Verlag. Ed. L. Solnica-Krezel. (2002)

Sakaguchi T.、Mizuno T.、Takeda H.：“卵黄合胞体层的形成和图案形成作用。”《斑马鱼的图案形成》，Springer-Verlag。