葉や花器官の背腹軸を決定する新規遺伝子FILを用いた表裏形成機構の解析

利用新基因FIL分析前后形成机制，该基因决定叶和花器官的背腹轴

• 批准号: 00J03636
• 负责人: 渡辺 恵郎
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J03636/
• 关键词: 向背; 発生; 植物の体軸

1 FIL promoter 5'領域におけるpromoter解析を行なってきた。GFPをマーカー遺伝子として、様々な長さのFIL promoter 5'領域を結合した形質転換植物を作成した。その結果、-1,800bp付近にある十数bpがFIL遺伝子の背軸側特異的発現様式に必要であることを明らかにしたFIL遺伝子の背軸側特異的発現様式に必要と考えられるシス因子を同定すべく、塩基配列に変異を入れた形質転換植物を14種類作製して、コア配列を決定した。その結果、FIL遺伝子が背軸側で発現するためには-1,800bP付近にあるAACGGGTGAATGという配列が必要であるととが分かった。この配列は、転写を抑制することでショウジョウバエの体節を決定しているKRUEPPEL(Kr)遺伝子の認識配列と類似していた。次に、この12bpに結合し、FIL遺伝子の発現制御を担っているトランス因子を同定すべく、酵母の1-ハイブリッド法を用いたライブラリーのスクリーニングを行い、252個の候補遺伝子を得た。現在、実際に同定した12bpの結合配列を認識するかどうか、生化学的な検証を行っている。2 FIL遺伝子の上流遺伝子を遺伝学的に同定するために、GFPが発現している形質転換植物体の種子をEMS処理した。約30,000粒をEMS処理し、実体蛍光顕微鏡を用いて154個体の突然変異体を選抜した。これらの内、#2.0-07-4突然変異体は劣性の突然変異体でGFPが背軸側だけでなく向軸側でも発現していた。走査型電子顕微鏡を用いた観察では、葉の向軸側に背軸側の特徴である気孔が多数分化していた。また、本葉の形態異常が見られ、著しい場合フィラメント状の本葉を生成する。樹。脂包埋法を用いてフィラメント状葉の光学切片を作製し、観察すると、向軸側組織が損なわれており、維管束の配向が異常になっていた。これらのことから、#2.0-07-4突然変異体では向軸側の分化決定が異常になっていると考えられた。そこで、#2.0-07-4突然変異体が既知の向軸側決定因子のアリルであるかを確かめるために、PHABULOSA、PHABOLUTA遺伝子、また、Kr遺伝子と同じC2H2タイプのzinc fingerドメインをコードしており、向軸側で発現しているSERRATE遺伝子、合計3遺伝子のcoding領域をシーケンスしたが#2.0-07-4突然変異体に多型は発見されなかった。#2.0-07-4突然変異体は現在4回の戻し交配を終えている。現在、ラフマッピングを行っており、#2.0-07-4突然変異体の原因遺伝子は番染色体下腕に座乗していることが明らかになった。この領域に既知の向背軸に関わる遺伝子は、存在していないことが明らかになった。

1 我们一直在 FIL 启动子 5' 区域进行启动子分析。产生转化植物，其中使用GFP作为标记基因连接不同长度的FIL启动子5'区域。结果表明，FIL基因的远轴侧特异性表达模式需要-1,800 bp左右超过10 bp。为了识别它们，我们创建了14种核苷酸序列发生突变的转化植物。并确定了它们的核心序列。结果发现，位于-1,800bP附近的序列AACGGGTGAATG是FIL基因在远轴侧表达所必需的。该序列与 KRUEPPEL (Kr) 基因的识别序列相似，该基因通过抑制转录来决定果蝇的体节分割。接下来，为了鉴定与这12bp结合并负责控制FIL基因表达的反式因子，我们使用酵母单杂交方法筛选文库，获得了252个候选基因。目前，我们正在进行生化验证，看看它是否能识别我们实际识别出的12bp结合序列。 2 为了从遗传上鉴定 FIL 基因的上游基因，用 EMS 处理表达 GFP 的转化植物的种子。大约 30,000 个谷物经过 EMS 处理，并使用立体荧光显微镜选择了 154 个突变体。其中，#2.0-07-4突变体是隐性突变体，其中GFP不仅在远轴侧而且在近轴侧表达。使用扫描电子显微镜观察发现，叶的正面分化出许多背面特有的气孔。另外，观察到真叶形状异常，严重时产生丝状真叶。树。采用脂肪包埋法制备丝状叶光学切片，观察发现近轴组织受损，维管束方向异常。这些结果表明#2.0-07-4突变体的近轴分化异常。因此，为了确认#2.0-07-4突变体是否是已知近轴决定因子的等位基因，我们编码了PHABULOSA、PHABOLUTA基因以及与Kr基因相同的C2H2型锌指结构域我们对三个基因的编码区进行了测序，包括近轴侧表达的SERRATE基因，但在#2.0-07-4突变体中没有发现多态性。 #2.0-07-4 突变体现已回交四次。目前正在进行粗略定位，结果显示#2.0-07-4突变体的致病基因位于数染色体的下臂。结果表明，该区域没有与近轴相关的已知基因。

项目成果

松本任考, 渡辺恵郎, 岡田清孝: "軸に依存した器官形態形成"「植物の形づくり」蛋白質核酸酵素2002年9月増刊. 47(12). 1564-1569 (2002)

Ninnobu Matsumoto、Keiro Watanabe、Kiyotaka Okada：“轴依赖性器官形态发生”“植物形状形成”蛋白质核酸酶 2002 年 9 月特别版 47(12) (2002)。