ゲノム不安定化の起源―チェックポイントと修復のクロストーク―

基因组不稳定的起源 - 检查点和修复之间的串扰 -

• 批准号: 08J40037
• 负责人: 中川 浩子
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J40037/
• 关键词: DNAアルキル化損傷; 放射線高感受性; NBS1; ユビキチン化; チェックポイント; DNA二本鎖切断修復; 核内フォーカス; MMS; DNA二本鎖切断(DSB); DNA損傷修復; 細胞周期チェックボイント; DNAアルキル化; タンパク質修飾; 細胞周期チェックポイント

放射線高感受性ナイミーヘン症候群の原因遺伝子NBSIは放射線によるDNA二本鎖切断修復と細胞応答に機能していることは明らかとされていたが、(1)哺乳細胞のNBS1を完全に欠失すると生存できないことや(2)NBS患者細胞にもNBS1のタンパク質断片を発現し、NBS1分子機能を残していると考えられること(3)NBS1がUVによるDNA損傷応答に機能することから未知機能を有していると考えられる。本研究においてはDNAにアルキル化損傷や塩基損傷に対するNBS1の細胞制御を観察した。1.NBS1はアルキル化損傷修復と細胞周期チェックポイントに重要な役割を担う。NBS1欠失細胞はMMSとMNNGと過酸化水素に対して感受性を示す。またNBS1ノックダウン細胞にMMS処理後、チェックポイントキナーゼCHK2のリン酸化の結果からチェックポイント活性が低下している。さらにNBS1は放射線照射だけでなく、MMS処理によっても核内でフォーカスを形成した。2.NBS1はDNAアルキル化損傷時のDNA複製クランプローダー因子RFC2のユビキチン化を制御する。NBS患者細胞のクロマチン画分にはMMS処理後、RFC2のユビキチン化によるmobility siftが見られなかった。NBS1はDNA二重鎖切断時のH2Bと紫外線損傷時にPCNAのユビキチン化に関わっている事が報告されているが、それらのDNA損傷時にRFC2のユビキチン化されるか調べた結果、MMS処理時のNBS1相補細胞のクロマチン画分においてのみ見られることがわかった。さらにNBS1はMMS処理によってRFC2と核内フォーカスにおいて共局在することが解った。3.NBS1はRAD18ユビキチンライゲースによるRFC2のユビキチン化に必要である。DNAアルキル化損傷時RFC2のユビキチン化はRAD18によって行われる。NBS患者細胞とNBS1相補細胞でRad18とRFC2の共沈を確認した結果、NBS1相補細胞においてのみRFC2と共沈するRad18とNBS1のバンドが見られた。またRad18欠失細胞はMMSに対して感受性を示す。NBS1の部位欠失変異体を用いてMMSへの感受性を調べるとRad18結合部位欠失したNBS1変異株ではMMSへの高い感受性を示す。本研究はNBS1がDNAアルキル化損傷修復においても重要な機能をもつことを明らかとした。

已经明确，NBSI（负责辐射敏感的 Nijmiehen 综合征的基因）在辐射诱导的 DNA 双链断裂修复和细胞反应中发挥作用，然而，（1）哺乳动物细胞中 NBS1 的完全缺失不允许它们存活； ; (2) NBS 患者细胞也表达 NBS1 的蛋白片段，并且被认为保留了 NBS1 分子功能；以及 (3) NBS1 具有响应紫外线诱导的 DNA 损伤的功能，因此人们认为它可能具有未知的功能。是。在这项研究中，我们观察了NBS1对DNA烷基化损伤和碱基损伤的细胞调节作用。 1.NBS1在烷基化损伤修复和细胞周期检查点中发挥重要作用。 NBS1 缺陷细胞对 MMS、MNNG 和过氧化氢敏感。此外，用 MMS 处理 NBS1 敲低细胞后，由于检查点激酶 CHK2 磷酸化，检查点活性降低。此外，NBS1不仅通过放射线照射而且通过MMS处理在核内形成焦点。 2.NBS1在DNA烷基化损伤时调节DNA复制夹装载因子RFC2的泛素化。 MMS 治疗后，NBS 患者细胞的染色质部分中未观察到 RFC2 泛素化导致的迁移率变化。据报道，NBS1参与DNA双链断裂过程中H2B的泛素化和紫外线损伤过程中PCNA的泛素化，发现它仅存在于NBS1互补细胞的染色质部分中。此外，在 MMS 处理后，发现 NBS1 与 RFC2 共定位于核灶中。 3.RAD18泛素连接酶对RFC2的泛素化需要NBS1。 DNA 烷基化损伤后 RFC2 的泛素化是由 RAD18 进行的。确认NBS患者细胞和NBS1互补细胞中Rad18和RFC2的共沉淀的结果是，仅在NBS1互补细胞中观察到Rad18和NBS1与RFC2共沉淀的带。 Rad18 缺陷细胞也表现出对 MMS 的敏感性。当使用NBS1的位点缺失突变体检查对MMS的敏感性时，缺乏Rad18结合位点的NBS1突变体表现出对MMS的高敏感性。这项研究表明NBS1在DNA烷基化损伤修复中也具有重要功能。

项目成果

Potential sensitivity of NBS cells to alkylating agents

NBS 细胞对烷化剂的潜在敏感性

• 发表时间: 2009
• 作者: Rintaro Yamaguchi;Masayuki Sato;Kazuhiro Ueta;藤本浩子
• 通讯作者: 藤本浩子