セルロースの1級水酸基の酸化で始まる新規生分解経路の解明

阐明从纤维素中伯羟基氧化开始的新型生物降解途径

基本信息

批准号：
08J07128
负责人：
金野尚武
金额：
$ 0.38万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J07128/
关键词：
セルロースグルクロナン多糖リアーゼ生分解 Trichoderma reesei

项目摘要

セルロース分解菌Trichoderma reeseiを、セルロースの酸化処理によって調製したセロウロン酸(β-1,4グルクロナン)を含む液体培地で培養した。T.reeseiはセロウロン酸を唯一の炭素源とする培地で生育することができ、菌体外液中に27kDaの分子最を持つタンパク質を最も多量に生産することが判明した。そこで検出したタンパク質のcDNAをT.reeseiの全ゲノム情報を用いてクローニングし、さらにメタノール資化酵母Pichia pastorisに導入し、組み換えタンパク質を大量発現させた。得られた組み換えタンパク質でセロウロン酸を処理し、分解生成物を^<13>C NMRで分析したところ、本酵素はβ-脱離反応によりセロウロン酸を分解するβ-1,4グルクロンナンリアーゼ(TrGL)であることが示された。TrGLのアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質を検索した結果、全てHypothetical proteinであり、どの多糖リアーゼ(PL)とも相同性を示さなかつたことから、本酵素は新規多糖リアーゼファミリー(PLファミリー20)に属することが明らかとなった。本研究により、セルロース分解菌として有名な糸状菌Trichoderma reeseiがグルクロナンリアーゼを生産することが初めて証明された。また、データベースを用いた配列解析から、約10のグルクロナンリアーゼ活性を有する可能性が高いタンパク質の存在が明らかになり、いずれも高い細胞壁(セルロース)分解能を有する微生物由来のタンパク質であった。これまで自然界におけるセルロースの分解機構としては、加水分解酵素(セルラーゼ)による分解のみが知られているが、本酵素の発見はセルロース分解にリアーゼ型酵素が関与することを示唆する重要な知見である。

将纤维素降解菌里氏木霉培养在含有通过氧化纤维素制备的纤维醛酸（β-1,4葡糖醛酸）的液体培养基中。研究发现里氏木霉可以在以纤维醛酸为唯一碳源的培养基中生长，并且在细胞外液中产生最大量的分子量为27 kDa的蛋白质。利用里氏木霉的全基因组信息克隆了其中检测到的蛋白质的cDNA，然后将其导入甲醇同化酵母毕赤酵母中，从而实现了重组蛋白的大规模表达。当用获得的重组蛋白处理纤维醛酸并通过 13 C NMR分析分解产物时，发现该酶是β-1，4葡糖醛酸裂解酶(β-1，4葡糖醛酸裂解酶(TrGL))。通过寻找与TrGL氨基酸序列具有高同源性的蛋白质，结果发现它们都是假设的蛋白质，并且与任何多糖裂解酶（PL）没有表现出任何同源性，因此该酶被归类为一种新型多糖很明显，它们属于裂解酶家族（PL家族20）。这项研究首次证明丝状真菌里氏木霉（一种著名的纤维素降解细菌）能够产生葡糖醛酸裂解酶。此外，利用数据库进行的序列分析显示，存在大约10种可能具有葡糖醛酸裂解酶活性的蛋白质，它们都是源自具有高降解细胞壁（纤维素）能力的微生物的蛋白质。迄今为止，自然界中唯一已知的纤维素分解机制是水解酶（纤维素酶）的分解，但这种酶的发现是一个重要发现，表明裂合酶型酶参与了纤维素分解。