セルロースの1級水酸基の酸化で始まる新規生分解経路の解明

阐明从纤维素中伯羟基氧化开始的新型生物降解途径

基本信息

批准号：
08J07128
负责人：
金野尚武
金额：
$ 0.38万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J07128/
关键词：
セルロースグルクロナン多糖リアーゼ生分解 Trichoderma reesei

项目摘要

セルロース分解菌Trichoderma reeseiを、セルロースの酸化処理によって調製したセロウロン酸(β-1,4グルクロナン)を含む液体培地で培養した。T.reeseiはセロウロン酸を唯一の炭素源とする培地で生育することができ、菌体外液中に27kDaの分子最を持つタンパク質を最も多量に生産することが判明した。そこで検出したタンパク質のcDNAをT.reeseiの全ゲノム情報を用いてクローニングし、さらにメタノール資化酵母Pichia pastorisに導入し、組み換えタンパク質を大量発現させた。得られた組み換えタンパク質でセロウロン酸を処理し、分解生成物を^<13>C NMRで分析したところ、本酵素はβ-脱離反応によりセロウロン酸を分解するβ-1,4グルクロンナンリアーゼ(TrGL)であることが示された。TrGLのアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質を検索した結果、全てHypothetical proteinであり、どの多糖リアーゼ(PL)とも相同性を示さなかつたことから、本酵素は新規多糖リアーゼファミリー(PLファミリー20)に属することが明らかとなった。本研究により、セルロース分解菌として有名な糸状菌Trichoderma reeseiがグルクロナンリアーゼを生産することが初めて証明された。また、データベースを用いた配列解析から、約10のグルクロナンリアーゼ活性を有する可能性が高いタンパク質の存在が明らかになり、いずれも高い細胞壁(セルロース)分解能を有する微生物由来のタンパク質であった。これまで自然界におけるセルロースの分解機構としては、加水分解酵素(セルラーゼ)による分解のみが知られているが、本酵素の発見はセルロース分解にリアーゼ型酵素が関与することを示唆する重要な知見である。

通过氧化处理纤维素氧化处理，将纤维素降解的细菌Trichoderma Reesei培养在含有cerouronic酸（β-1,4葡萄糖醛酸）的液体培养基中。 T. reesei可以在培养基中生长，用炉子酸作为唯一的碳源，并且发现它在体外液体中产生的蛋白质最大，最高分子为27KDA。然后使用T. resei的整个基因组信息克隆检测到的蛋白质的cDNA，然后引入甲醇辅助的酵母菌Pichia Pastoris，并大量表达重组蛋白。将所得的重组蛋白用二抗酸处理，并通过 ^<13> c NMR分析降解产物，并表明该酶是β-1,4葡萄糖醛酸裂解酶（TRGL），该酶通过β-启示反应降解cerouronic酸。搜索与TRGL氨基酸序列具有高同源性的蛋白质表明，它们都是假设的蛋白质，并且与任何多聚糖酸酯酶（PL）并非同源，这表明该酶属于新型多糖酸酯裂解酶家族（PL家族20）。这项研究首次证明了著名的纤维素降解真菌Trichoderma Reesei产生葡萄糖民烯基裂解酶。此外，使用数据库的序列分析揭示了可能具有大约10种葡萄糖丹尼基裂解酶活性的蛋白质的存在，并且它们都是微生物衍生的具有高细胞壁（纤维素）分辨率的蛋白。到目前为止，只有自然界中纤维素的降解是通过水解酶（纤维素酶）的，但是这种酶的发现是一个重要发现，表明裂解酶型酶参与纤维素降解。