細菌べん毛固定子のナトリウム取り込み活性測定系の構築とエネルギー変換機構の解明

细菌鞭毛定子吸钠活性测定系统的构建及能量转换机制的阐明

• 批准号: 08J04323
• 负责人: 寺島 浩行
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J04323/
• 关键词: 細菌べん毛; 回転モーター; イオン結合ポケット; エネルギー変換; PomAB; イオン透過経路; in vitro再構成; ナトリウム; 雷気化学ポテンシャル差; 無細胞タンパク質合成

細菌のべん毛モーターは、膜内外の共役イオンの電気化学的ポテンシャル差をべん毛の回転に変換する。べん毛モーターの回転機構の解明のためには、エネルギー変換ユニットがどのようにイオンを透過しているのか明らかにしなければならない。そのために、PomA/B複合体のNa^+取込み活性の測定と、イオン透過経路を形成すると思われる残基への変異導入による運動能の解析をし、イオン透過と回転力発生機構の解明を目指した。無細胞タンパク質合成系を用いたPomA/Bの合成、あるいは、CHAPS、Cymal-5によるPomA/B複合体の精製をし、プロテオリポソームに再構成したPomA/BのNa^+の取込み活性の測定を試みたが、有意なNa^+の取込みは検出できなかった。PomBの膜貫通領域に変異を導入し、運動能回復変異体の取得を行った。PomB-L28A/C31Aの運動能を回復させる変異が、PomAの4番目の膜貫通領域のPomA-L183Fであることを見出し、PomAの4番目の膜貫通領域がイオン透過経路に重要であることが示唆された(BIOPHYSICS誌)。また、共役イオンの結合残基であるPomB-D24の電荷を無くしても、べん毛を回転させることができる変異をPomAの膜貫通領域で見つけた(PomA-N194D/PomB-D24N)。PomA-N194はPomB-D24の機能を代替でき、PomA-N194とPomB-D24がNa^+結合ポケットを形成することが示唆された。また、負電荷を持つ側鎖の長さを変化させると運動能が低下することから、適切な側鎖の長さが固定子の機能に対して重要であることが示唆された。これらの成果は、Journal of Moleclular Biology誌に掲載された。本年度の研究によって、共役イオンの結合、透過メカニズムとエネルギー変換機構に対する新たな知見を得ることができた。

细菌鞭毛马达将膜内外共轭离子之间的电化学势差转化为鞭毛旋转。为了阐明鞭毛马达的旋转机制，有必要明确能量转换单元如何传输离子。为此，我们测量了PomA/B复合物的Na^+吸收活性，通过向被认为形成离子渗透途径的残基引入突变来分析其运动性，并阐明了离子渗透和旋转力产生的机制。使用无细胞蛋白质合成系统合成PomA/B，或使用CHAPS或Cymal-5纯化PomA/B复合物，并测量重构为蛋白脂质体的PomA/B的Na^+摄取活性，但没有显着的Na^+。可以检测到吸收。我们在PomB的跨膜区引入了突变，并获得了运动性恢复的突变体。我们发现恢复 PomB-L28A/C31A 运动性的突变是 PomA-L183F，即 PomA 的第四跨膜区，并证明 PomA 的第四跨膜区对于离子渗透途径很重要（BIOPHYSICS 杂志）。我们还在 PomA 的跨膜区域发现了一个突变，即使 PomB-D24（共轭离子结合残基）上的电荷被去除，鞭毛也可以旋转（PomA-N194D/PomB-D24N）。 PomA-N194可以替代PomB-D24的功能，表明PomA-N194和PomB-D24形成Na^+结合袋。此外，改变带负电侧链的长度会降低运动性，这表明侧链的适当长度对于定子的功能很重要。这些结果发表在《分子生物学杂志》上。通过今年的研究，我们对共轭离子的结合、传输机制、能量转换机制有了新的认识。

项目成果

Analysis of the coupled ion binding site in the stator complex of Na^+-driven flagellar motor.

Na^驱动鞭毛马达定子复合体中耦合离子结合位点的分析。

• 发表时间: 2009
• 作者: Megumi Yoshida;Takayuki Saito;Satoshi Ishii;Shigeto Otsuka;Keishi Senoo;Masafumi Koike;Yuki Sudo;Hiroyuki Terashima;Hiroyuki Terashima;寺島浩行;寺島浩行;Hiroyuki Terashima
• 通讯作者: Hiroyuki Terashima

細菌べん毛固定子複合体の共役イオンの透過経路と結合残基

细菌鞭毛定子复合物的共轭离子渗透途径和结合残基

• 发表时间: 2009
• 作者: Megumi Yoshida;Takayuki Saito;Satoshi Ishii;Shigeto Otsuka;Keishi Senoo;Masafumi Koike;Yuki Sudo;Hiroyuki Terashima;Hiroyuki Terashima;寺島浩行;寺島浩行
• 通讯作者: 寺島浩行

細菌べん毛モーター固定子のナトリウム流入活性の測定の試み

尝试测量细菌鞭毛运动定子的钠流入活性

• 发表时间: 2008
• 作者: Megumi Yoshida;Takayuki Saito;Satoshi Ishii;Shigeto Otsuka;Keishi Senoo;Masafumi Koike;Yuki Sudo;Hiroyuki Terashima;Hiroyuki Terashima;寺島浩行;寺島浩行;Hiroyuki Terashima;寺島浩行;寺島浩行
• 通讯作者: 寺島浩行

The essential Asp residue of the ion binding site in the stator protein, PomB, can be replaced into the partner stator protein, Pom in bacterial flagellar motor

定子蛋白 PomB 中离子结合位点的必需 Asp 残基可被替换为细菌鞭毛运动中的伴侣定子蛋白 Pom

• 发表时间: 2010
• 作者: Megumi Yoshida;Takayuki Saito;Satoshi Ishii;Shigeto Otsuka;Keishi Senoo;Masafumi Koike;Yuki Sudo;Hiroyuki Terashima;Hiroyuki Terashima
• 通讯作者: Hiroyuki Terashima

Cell-free Synthesis of the Torque-Generating Membrane Proteins, PomA and PomB, of the Na^+-driven Flagellar Motor in Vibrio alginolyticus

溶藻弧菌 Na^ 驱动鞭毛马达扭矩生成膜蛋白 PomA 和 PomB 的无细胞合成

• 发表时间: 2008
• 期刊: Journal of Biochemistry 144
• 作者: Megumi Yoshida;Takayuki Saito;Satoshi Ishii;Shigeto Otsuka;Keishi Senoo;Masafumi Koike;Yuki Sudo;Hiroyuki Terashima
• 通讯作者: Hiroyuki Terashima